pGSK-3β和NF-κB在慢性支气管哮喘小鼠气道重塑中的
表达水平及意义
蒋光，杨远
【摘 要】【摘要】目的 探讨磷酸化糖原合成酶激酶 3β（phosphor-Ser9 glycogen synthase kinase3β，pGSK-3β） 和核因子 kappa B（nuclear factor kappa B，NF-κB）的表达水平在慢性支气管哮喘气道重塑中的作用。方法 16 只雄性 BALB/c 小鼠随机分为2 组：支气管哮喘组与对照组，每组 8 只，通过卵蛋白致敏和雾化激发制备小鼠慢性支气管哮喘模型，对照组全部以生理盐水代替；2 组小鼠分别在末次激发后 24 h 内颈椎脱臼处死，取左肺通过 HE 染色，光学显微镜观察气道重塑情况；取右肺采用蛋白质印迹方法测定肺组织 pGSK- 3β、NF-κB、MMP-9的表达量。结果 ⑴支气管哮喘组出现管壁增厚，平滑肌增生、黏液分泌增加等气道重塑的特征性改变；⑵对照组 pGSK-3β、NF-κB、MMP-9 的表达水平均小于支气管哮喘组（P＜0.05），三者在慢性支气管哮喘小鼠中表达量增加。结论 卵蛋白致敏反复雾化激发可导致气道重塑，GSK-3β/NF-κB 信号转导途径在支气管哮喘气道重塑中起重要作用。 【期刊名称】中国医药生物技术 【年(卷),期】2010(005)004 【总页数】4
【关键词】【关键词】 哮喘； 疾病模型，动物； 糖原合成酶激酶类； NF-κB 支气管哮喘是气道慢性炎症性疾病，反复炎症刺激可引起组织损伤及后续的组织结构的改变即气道重塑[1]，其确切发生机制尚不十分清楚。糖原合成酶激酶 3β（glycogen synthase kinase3β，GSK-3β）是真核生物中广泛存在的丝/苏
氨酸蛋白激酶，参与多种细胞过程和信号转导途径，可以参与核因子 kappa B（nuclear factor-kappa B，NF-κB）信号通路的调节。文献[2]报道 GSK3β 主要通过调节 NF-κB 核转位及亚基 p65 磷酸化而影响核因子的活性，而 NF-κB又是多向调节功能的转录因子，广泛参与许多基因的转录调控，包括基质金属蛋白酶 9（matrix metalloprotease-9，MMP-9）基因[3]，是重要的炎症反应调节因子，它们在许多疾病生理病理过程中起重要作用，近年研究发现GSK-3β 具有逆向调节心肌肥厚[4]、气道平滑肌肥大增生[5]的作用，Bentley 等[6]发现急性支气管哮喘模型的气道平滑肌细胞肥大、增生，上皮细胞和炎症细胞中失活的磷酸化 GSK-3β（pGSK-3β）含量增加。全肺 pGSK-3β 增加，GSK-3β 活性降低，说明 GSK-3β 磷酸化、失活促进气道平滑肌重塑。有关 GSK-3β 在慢性哮喘气道重塑过程中的表达及作用尚不清楚。本实验旨在利用卵蛋白致敏和激发的慢性支气管哮喘小鼠模型，探讨支气管哮喘气道重塑形成过程中 GSK-3β、NF-κB 和mmP-9 的表达情况及相互关系，为气道重塑的发生机制提供新的理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器
清洁级雄性 BALB/c 小鼠 16 只，6 周龄，体重 16～20 g，许可证号：SCXK（苏）2007-0001，购于扬州大学比较医学中心；V 级鸡卵清蛋白（ovalbumin，OVA）购自美国 Sigma 公司；兔抗磷酸化糖原合成酶激酶-3β（Ser9）多克隆抗体购自美国 Cell signal 公司；鼠抗 NF-κB p65 单克隆抗体购自美国 Santa Cruz 公司；兔抗mmP-9 多克隆抗体购自美国 Santa Cruz 公司；β-actin 购自美国 Santa Cruz 公司 。SB-15347 垂直电泳仪购自美国 GE
公司；XXOV-450 半干转膜仪购自美国Bio-Rad 公司；硝酸纤维素膜购自美国 Bio-Rad 公司；增强化学发光剂（ECL）购自美国 GE 公司；Cymentre 2000 柯达活体成像仪购自美国 Kodak公司。 1.2 方法
1.2.1 慢性支气管哮喘小鼠模型制备 将小鼠随机分为2 组：哮喘组和对照组，每组 8 只。小鼠适应性饲养 1 周后，采用卵蛋白致敏和激发法[7]建立支气管哮喘小鼠模型。哮喘组于第0、14 天腹腔注射 OVA 10 μg + 氢氧化铝 2 mg 的生理盐水悬液 0.1 ml，第21 天开始以 2.5%OVA 雾化激发，30min/d，每周 3 d，共 6 周；对照组全部以生理盐水代替。
1.2.2 取材 2 组小鼠末次激发后 24 h 内颈椎脱臼处死动物，迅速打开胸腔，取出左肺于 10%中性福尔马林溶液中固定 24 h。肺标本严格于垂直位石蜡包埋，切片，片厚 3 μm。右肺用 PBS 液冲洗后入 –70℃低温冰箱中保存备用。 1.2.3 HE 染色 取左肺组织切片行 HE 染色，光学显微镜观察（观察倍数 10×40）支气管及周围的炎性细胞浸润情况及黏膜和平滑肌的变化。
1.2.4 pGSK-3β、NF-κB p65 和mmP-9 蛋白表达的检测 从 –70℃低温冰箱中取出右肺组织标本，剪碎后，加入蛋白质裂解缓冲液及蛋白酶抑制剂，置于玻璃匀浆器中研磨，冰上匀浆，4℃14 000×g 离心 5min，取上清液，蛋白质印迹法[8]测定蛋白质含量。取上述上清液按上样量 40 μg 上样，加等体积的上样缓冲液稀释，经聚丙烯酞胺变性凝胶电泳分离蛋白，采用试剂说明书提供的电转法将蛋白转至 PVDF 膜上，依次加入封闭液、一抗（稀释度 1∶1 000）、辣根过氧化物酶标记二抗，再经化学发光剂反应，X 光片压片曝光。自动获取图片结果。相应蛋白表达值为条带的灰度值除以 β-actin（1∶1 000，43 KD）内
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