生物技术在香精香料生产中的应用

生物技术在香精香料生产中的应用

天然香料不断增长的市场需求 , 促进了香精香料生产技术的迅速发展。 尽管传统的化学合 成和天然提取方法还在起重要的作用 , 但是利用生物技术生产香料化合物正受到人们越来越 多的重视。利用微生物发酵来模拟植物次级代谢过程可生产出香料化合物 , 而且这些香料化合 物已被欧洲和美国食品法规界定为“天然的” 。这种标识体现着市场的一种强烈要求。 1

历史

自从啤酒、葡萄酒和乳酪等相关发酵产品的问世 , 微生物发酵过程一直在食用复杂香味物 质的发展中起着重要的整合作用。 当代生物技术已从手工工艺进化到大规模工厂化生产。 150 年前,苯甲醛是第一个被鉴定的香料化合物 (LiebigandWohler 1837)[1],而 香兰素的分离、鉴定和合成标志着当代香料工业真正的开始

(TiemannandHaar

mann 1874, ReimerandTiemann 1876)[1],第一篇有关微生物香料的综述 发表于 1923年[2] 。早在十

九世纪五十年代初 ,经典的有机分析方法就被刚刚发明的气相色谱 所取代 , 这一技术也促进了挥发性化合物的分离和结构鉴定发展。近年来 产香精香料的文章发表越来越多

, 有关利用微生物生

(Armstrongetd 1993, Berger 1996, Ta

keokaetal 1995)[3-5]。早期的研究主要集中在筛选可产生芳香化合物的微生物菌 种上, 而现今微生物

技术 (包括基因工程 ), 正越来越多地应用于提高生物催化剂的催化效率。 全世界香精香料工业的规模是巨大的 ,1994 年估计有 97亿美元, 同时约有 6400种天然香料和 10000 种合成香料为人们所掌握。 其中常用的有几百种 , 每年生产规模在 1 吨以上的香料约有 400 种。现在 , 每年有几千吨非挥发性香料化合物 , 如甜味剂、酸味剂和咸味物质是通过生物 技术生产的。 尽管生物工程应用于挥发性香料化合物的研究只是最近才成为热点

(Haged

ornandKaphammer 1994)[6],但是进入工业化生产的产品已经存在 ，主要为脂

肪族羰基化合物、羧酸酯和苯甲酸酯 ，包括内酯、香兰素和一些特殊化合物 (Cheetha m 1996)[7] 。 2

香料生物技术使用香精香料的产品 (如方便食品、饮料、化妆品、去污剂 )不断增长的 市场份

80%的香精香料是由

额要求业内企业要有全新的策略来生产芳香化合物。全世界约有

化学法合成的 , 然而在德国 (1990 年)约有 70%的食用香料是天然的 (Ahrahamet .a l .)[1], 这一趋势要归功于新型营养健康生活观念的建立。上述“天然的”标记对于利用微 生物技术生产香料的研究是非常重要的 , 因为天然的和化学合成的香料在价格上差距是巨大 的, 例如每公斤合成香兰素的价格为 12 美元左右 , 而每公斤从香荚兰豆提取的香兰素是 4000 美元。此外, 生物技术还会显现出其它的优点 , 香料是生物活性物质 , 手性对其香味具有重要的 影响 , 而生物催化剂可选择性地催化合成出手性化合物。生物技术进一步的优点是 1. 2. 3. 2.1

独立于农业之外 , 可不受于地方不利环境条件所限制。 可利用工程技术方法进行放大和工业化生产 , 产品易于回收。 可为发展中国家保护天然资源。

由代谢路径到目标香料化合物高等植物精油、 果汁、 植物提取物和一些少量的动物 长期以

:

来是天然香料的唯一来源 , 而生物技术主要包括微生物、 植物细胞和酶的单步生物转化

和从头合成 ,完整细胞可用于复杂目标化合物的生物催化合成 , 而游离酶可用于单步反应过程 的催化。在微生物中 , 真菌(特别是担子菌 )所产生的挥发性物质与植物挥发物质极其相似 多真菌挥发性物质已经被确定 , 结构上也等同于高等植物香料。 2.1.1

从头合成完整微生物细胞可催化完成碳水化合物、 脂肪和蛋白质的代谢过程 , 且可 将降

, 许

解后的化合物转为更复杂的香料化合物分子。普通的发酵培养可产生大量的初级代谢产 物和微量的复杂芳香化合物。例如在乳品中乳酸大量产生的同时 , 一些微量的挥发性香料 , 如 短链醇、醛、酮、甲基酮以及吡嗪、内酯、硫醇类化物也伴随着产生。乳酸的生成也无需多 论,但如何通过发酵工程技术提高潜在香料化合物还需进行深入的研究

谢物的调节以及能荷调节来达到促进香料化合物的生物合成。 2.1.2

生物转化和生物合成 : 价廉易得的可再生的天然前体物 , 如脂肪酸和氨基酸 , 可以 通过微

,然而, 这方面的研究

进展受到代谢规律缺乏的限制。可能有效的方法是通过代谢流的研究结合酶的诱导、反馈调 节、分解代

生物发酵和酶工程技术转化为高附加值的香料化合物。生物催化优于化学催化主要在 于: (1) (2) (3) (4)

手性的引入 ,

化学惰性碳原子的功能转化 ,

在多功能分子中选择性修饰特定的基团 ,

手性香料化合物的拆分。 下面就最近研究热点中的几种香料化合物生物技术运用作一 介绍。

400种结构，组成了一群合适的前体底物，土壤细

, 到目前为止 , 大多数单萜的生

a .单萜单萜在自然界中广泛存在约有

菌和高等真菌可将其转化为非环、单环、双环的类单萜化合物

物转化只停留在研究上 ， 暂且不具有实质商业价值 ， 主要的问题在于 : (1) (2) (3) (4)

单萜前体化合物和产物的化学不稳定性。 单萜化合物的低水溶性。

前体和产物的高挥发性 ; 前体和产物的高细胞毒性。 低转化率。

b .高萜/萜类化合物高萜生物转化中,萜类前体化合物的细胞毒性不再是个主要障碍

在1.2 gl -1左右。10-羟基广藿酮再由化学法转化为降绿叶烯醇 料。c .香兰素香兰素是一种被广泛接受的香料化合物

,转

化率和产率就相应有所提高。 例如广藿醇被土壤微生物选择性羟基化 ， 转化为 10- 羟基广藿酮 产率

,此为广藿香精油中的

一种主要成份(Suhara 1981)[8] Cheetham (1993)[9]。研究报道利用真菌可将 3-紫罗兰酮转化为烟草香

，主要存在香

荚兰豆中 ,含量为 7%左右, 目前国际市场上只有 0.2%香兰素是天然的 , 其余都是化学合成的。 受货源限制和高昂价格的趋使 , 生物转化法得到广泛的研究。目前 , 植物细胞培养和微生物转

化法都不能提供一个可以接受的转化率。前体化合物法似乎更有前景。几种合适的起始原料 包括：木

素,丁子香酚、阿魏酸、姜黄素和泰国安息香树脂。转化率 率。

30%左右，产率1 gl -1左

右已有研究报道。 前体化合物和产物的毒性以及产物在发酵过程中的降解 , 都会影响最终产品 的得

d .苯甲醛在数量上，苯甲醛是第二大主要的香料，天然的苯甲醛通常来源于苦杏仁核 ，而

在生产过程中同时产生的等摩尔氢氰酸可能会引起严重的安全问题。最近科学家发现利用微 生物转化天然的苯丙氨酸可合成出苯甲醛 ， 这就为苯甲醛的生产提供一条新的途径。 此过程的 研究开发正在充足廉价的天然苯丙氨酸保证下进展顺利。

究有助于避免副反应而提高生物转化效率。有人曾用次

L -苯丙氨酸的微生物代谢过程的研 -L -苯丙氨酸特异标记来阐述Isc

,通过研究可知苯丙氨酸通过两

hnodermabenzoincm的深层发酵代谢路径

个不同的降解途径可完全转化为香料化合物苯甲醛和苯丙醇。 转化为苯甲醛同样也被发现于细菌的代谢过程中。

L -苯丙氨酸通过氧化降解途径

e . 癸内酯内酯是一种常用的挥发性香料。 脂肪族链烷酯作为重要的食用香料是源于它们 特殊的

味感特性。癸内酯是一个重要的组份 ， 存在于许多水果中 ， 如草莓、桃子和杏以及奶制 品和一些发酵食品。随着八十年代内酯生物生产过程的建立 ， 天然癸内酯价格从 20000 美元 / kg降到1200美元/ kg。通常,微生物内酯是通过羟基脂肪酸的 的产品得率为 5gl -1 。 2.1.3

3 -氧化生产的，此转化过程

游离酶到目前为止 ，约 3000 种酶在文献中被报道 ， 但只有几百种可商业化生产 ，且

其中仅 20 种适合于工业生产过程 ， 脂肪酶、酯酶、蛋白酶、核酸酶和糖苷酯酶可用于香料化 合物的提取过程 ， 而且还可将大分子前体化合物水解为小分子香料物质 ， 一个很好的例子是脂 水解反应的逆反应即脂肪酶非水相酯化反应。这些酶还可用于脂肪族酯、芳香酯和内酯的立 体选择性水解和转酯反应。 3

芳香化合物的生物工程技术前景

欧盟目前的一个研究课题主要应用基因工程来将单萜转化为具有强烈香味活性的功能氧 化产品。一个野生Pseudonounapultrda菌株作为宿主

啤酒中的双乙酰 ，通过添加一种携带了 a-乙酰乳酸酯脱羧酶的基因工程菌

，向其引入一个编码

，来去

单萜转化酶的基因从而使之具有特殊催化功能的基因工程菌。另一个实用的例子是利用基因 修饰来去除除双乙酰前体物的形成 ， 这样耗时后发酸过程可不再需要。 相同的单基因操作方法曾应用于一 种携带丙乳酸酶的啤酒酵母 ，此方法可降低酒的酸性 ，改善挥发性成份的组成。 当然，目前在利 用完整的代谢过程来生产芳香化合物还存在一些技术限制。 实际上 ， 每一个生物过程都是建立 在： 合适微生物的筛选、 全套化学物理参数的调节、 反应器设计和在线控制等基础上的。 如果 目标产物为一个挥发性香料 ， 还存在一些其他的问题 ： 1.

前体的筛选 ， 添加的时间和方式。

原位产品的回收 ：产品的保护 ，代谢平衡的转移 ， 反馈抑制的去除 ， 产品的细胞毒性。 连续发酵 ： 产品生成有时可能会与生长同步 ， 然而许多挥发性代谢产物不是在稳定期积

2. 3.

累的次级产品。 尽管许多微生物发酵母过程被报道可产生有吸引力的香料化合物

， 但是可以工