HPLC法测定彝药火把花根中雷公藤甲素的含量
火把花根又名昆明山海棠[Tripterygium hypoglaucum（Levl.）Hutch.]是卫矛科（Celastraceae）雷公藤属[Tripterygium Wilfodii（Hook.）f.]落叶披散或蔓状灌木植物，又名雷公藤、断肠草、紫金皮、掉毛草、六方藤等。生长于向阳山坡、路边或灌木丛中，通常作为药用的部位为根和皮，昆明山海棠为中国特有的植物，民间药用中草药。主要分布于我国的西南地区，云南省境内尤为多见，主要集中分布于昆明、楚雄、红河、玉溪等地。火把花根彝语为“一姑妹班”、“多争唯”意译为“开花像火把样通红的植物。在西南地区彝族药用历史悠久。主要用于治疗慢性肾炎、类风湿性关节炎、红斑狼疮等。火把花一名始载于《本草纲目》，李时珍集解曰：“生滇南者花红，呼为火把花。[1]昆明山海棠有效成分研究多有报道，但是其含量测定研究少见。火把花根药材收载于《云南省药品标准》（1974年）、《云南省中药材标准》第二册?彝族药（2005年）。现行《中国药典》收载的昆明山海棠片以重量法进行含量测定，且测定方法相对简单，检验灵敏度、重现性还有待提高[2]。上述标准中均无火把花根药材的含量测定项目，有必要对此项目进行研究。
火把花的化学成分较为复杂，长期研究发现火把花中含有生物碱类雷公藤碱（wilfordie）、雷公藤次碱（wilfori）、雷公藤甲素（Triphonide）等，其中最主要的活性成分为雷公藤甲素。[3]雷公藤甲素为环氧二萜类内脂化合物，其药理作用为：抗排斥作用、抗肿瘤作用、抗生育作用等。[4]雷公藤甲素有较强的抗肿瘤活性，并具有广谱、高效等特点，可以用于类风湿性关节炎、强直性关节炎等多种自身免疫疾病和炎性疾病的治
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疗。[5]目前，对于火把花根中的雷公藤甲素的含量测定方法已经有文献报道，但是由于研究的方法不够完善和统一，得出的结果差异性较大。因此，本次研究在现有的火把花根中雷公藤甲素的含量测定的基础上，运用HPLC色谱法，对火把花根药材进行了一系列的试验，建立了一个对火把花根中雷公藤甲素进行含量测定的方法，为以后科学评价和有效控制雷公藤药材的质量提供了可靠的科学依据。 1仪器与试药
1.1仪器安捷伦1100高效液相色谱仪（美国Agilent公司真空在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、UV检测器），赛多利斯BSA224S-CW电子天平，赛多利斯BP211D电子天平，DHG-9104型鼓风干燥箱，KQ-500E型超声波清洗器，YS-04A小型高效粉碎机，Agilent Cary 60 UV-Vis紫外分光光度仪。
1.2试药雷公藤甲素对照品（中国食品药品检定研究院）批号为：111567-201404，标示量为：99.8%；分析纯：甲醇（四川西陇化工有限公司）、三氯甲烷（四川西陇化工有限公司）、乙醚（四川西陇化工有限公司）、乙酸乙酯（四川西陇化工有限公司）、中性氧化铝（国药集团化学试剂有限公司，200-300目），批号为：20130328色谱纯为甲醇（德国默克试剂公司）；水为超纯水。 2方法与结果
2.1薄层色谱鉴别取本品粉末约5 g，加80%甲醇30 mL，超声30 min，放冷至室温，滤过，取滤液。滤液加三氯甲烷振摇提取3次，每次15 mL，合并三氯甲烷液，并将滤液低温蒸干。残渣加5ml甲醇完全溶解后用含5 g
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中性氧化铝的洗脱柱（内径为1.2 cm，200目），洗脱液为甲醇：乙酸乙酯：乙醚=1：2；1 60 mL进行洗脱至无色，蒸干洗脱液，残渣加1 mL甲醇溶解作为供试品溶液。另取雷公藤甲素对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2015年版四部通则0502）试验，吸取上述两种溶液各10 uL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷―乙醚（2：1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%3，5―二硝基苯甲酸乙醇溶液与2mol/l氢氧化钠乙醇液的混合液（临用前按1：3混合）作为显色剂，喷雾显色，自然光下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
2.2检测波长的确定取雷公藤甲素对照品适量，精密称定，加甲醇溶解制成每1 mL含0.2 mg的溶液，作为雷公藤甲素对照品溶液。取雷公藤甲素对照品溶液经紫外分光光度仪进行波长扫描，最大吸收波长为217 nm。结果如图1，由图1可知，雷公藤甲素的检测波长为217 nm。图1雷公藤的全波长扫描图谱
2.3色谱条件与系统适应性色谱柱：Agilent Venusil PLOW-C18柱（4.6×150 mm，5 um）；流动相：甲醇-水（40：60）检测波长：217 nm柱温：35℃；流速：1 mL/min；进样：10 uL；分析时间：40 min。 2.4溶液的制备
2.4.1对照品溶液的制备对照品溶液制备：取雷公藤甲素对照品适量，精密称定，加甲醇溶解制成每1 mL含0.2 mg的溶液，即得。 2.4.2供试品溶液的制备供试品溶液的制备：取本品粉末（过三号筛）约5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇30 mL，称定重量，
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超声处理（功率250W，频率50kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，滤液移置分液漏斗中，加水7 mL，用氯仿振摇提取3次，每次15 mL，合并氯仿液，蒸干，残渣转移至中性氧化铝柱用60 mL洗脱液进行洗脱（中性氧化铝：5 g；洗脱柱内径：1.2 cm；洗脱液体积：60 mL；洗脱液：甲醇-乙酸乙酯-乙醚=1∶2∶1），收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。 2.5方法学考察
2.5.1专属性考察在检测波长：217 nm；柱温：35℃；进样量：10 uL；流动相：甲醇-水（40：60）；的HPLC色谱条件下，将雷公藤甲素对照品溶液、样品溶液进行HPLC分析，得到相应的色谱图。结果如图2所示，对照品的保留时间与样品的保留时间一致，说明该检测条件、方法专属性良好。图2雷公藤样品图谱
2.5.2线性关系考察取雷公藤甲素对照品，分别配制成浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL的对照品溶液，进行高效液相色谱分析，以进样浓度（mg/ml）为横坐标，峰面积（mAU*s）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：Y=20507X-6.3579，R2=0.9999，结果见表1。实验结果表明在进样浓度为0.01mg/ml～0.06mg/ml的范围内，线性关系良好。
2.5.3重复性考察按照供试品溶液的制备方法重复处理六份供试品溶液，进样10 uL，进行高效液相色谱法检测，并记录雷公藤甲素的峰面积，结果见表2，由检测结果可知RSD%
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1、生气，就是拿别人的过错来惩罚自己。原谅别人，就是善待自己。 2、未必钱多乐便多，财多累己招烦恼。清贫乐道真自在，无牵无挂乐逍遥。
3、处事不必求功，无过便是功。为人不必感德，无怨便是德。
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