小麦抗白粉病基因Pm21与其它同类抗白粉
病基因聚合效应的研究
一、实验名称
小麦抗白粉病基因Pm21与其它同类抗病基因聚合效应的研究 二、项目的研究背景和目的、意义
小麦白粉病是由小麦白粉病菌(Erysiphe gramin D c．f．sp．tritici E．Marcha1)引起的真菌性病害。20世纪60年代以来，由于小麦半矮秆品种的推广，氮肥施用量的增大，白粉病的危害日趋严重，在世界主要麦区由次要病害上升为主要病害，也成为我国小麦安全生产的主要限制因子。化学防治增加人力、物力投入，还会引起环境污染等生态问题，培育和推广抗病品种是防治小麦白粉病最为经济、安全和有效的途径。
近十年来，随着分子标记的广泛利用，在六倍体小麦中已陆续报道了一些抗白粉病QTL。这些QTL主要分布在染色体1B、2B、4B和7D上(Kelleret a1．，1999；Liu et a1．，2001；霍纳新等，2005；王竹林等，2006；刘慧远等，2006；B6mer et a1．，2002；Bougot et a1．，2006；Liang et a1．，2006；Tucker et a1．，2006；2007；黄清华等，2008；Lillemo et a1．，2008)。此外，在1A、2D、5A、5D和6A等染色体上也存在抗白粉病的主效OTL(Keller et a1．，1 999；Chantret et a1．，2000；2001；Btimer et a1．，2002；霍纳新等，2005；王竹林等，2006；Liang et a1．，2006；Jakobson et a1．，2006；Ltllemoet a1．，2008)。这些OTL的定位和与其紧密连锁的分子标记的获得，为借助分子标记进行慢粉性抗病育种奠定了很好的基础。
Pm17在欧洲己开始受到关注(Mohler et a1．，2001)。Pm19除了不抗中国白粉菌优势小种外，抗其它生理小种。可以把Pml9和其它Pm基因组合使用，这样不仅能改进小麦的抗病性，还可改良其加工品质，丰富小麦的遗传多样性(吴先华等，2006)。Pm21不仅抗中国目前报道的所有白粉菌毒力型及被检测的120个欧洲小种，而且其载体品种无明显的不良性状，在不同小麦遗传背景下抗病性均表现稳定(刘金元等，1999)。目前，Pm21己经被转育到栽培品种(刘金元等，2000；杨足君等，2000)，并在生产中应用。含有Pml2，Pm13，Pm16，Pml8(Pmlc)基因的品种或品系农艺性状较差，不宜直接作育种亲本(Zhou ct a1．，2005)。Pm17虽然对白粉病抗性较弱，但其1R具有良好的增产性能和拥有对麦二叉蚜的抗性，因此可以作为背景抗性与其它抗病基因组合使用。在Pm24(Huang et a1．，2000)以后鉴定的基因中，除Pm30(Liu et a1．，2002)、Pm31(xie et a1．，2003)和Pm33(Zhuet a1．，2005)为我国学者发现外，其他基因还有待引进，在我国的利用价值还有待于进一步鉴定。
一些育种单位借助分子标记技术将多个抗病基因转育到生产品种中去，取得了十分显著的效果。刘金元等 利用与Pm2和Pm4a紧密连锁的RFLP标记对抗病的小麦品种或品系进行辅助选择，成功地将3个抗白粉病基因组合Pm2+Pm4a、Pm2+Pm21和Pm4a+Pm21聚合到优异小麦品种“扬麦158”中。
虽然已有一些应用分子标记检测抗病基因的技术手段来辅助育种，但是研究领域多集中于抗性基因的发现与定位，而应用层面的研究也多集中于单个基因的应用，虽然大家已经认识到多基因聚合的意义，但在这方面的系统性研究还较少见。通过寻找与抗病基因紧密连锁的分子标记对基因进行定位，有利于把多个基因聚合到同一个品种中，提高抗病品种的使用年限。多个抗病基因的聚合是获得对白粉病持久抗性的有效策略。
多基因聚合会表现基因的互作与累加效应，从而出现新的或更强的抗病性。本研究的目标是借助分子标记检测抗病基因的技术手段来研究多个抗性基因聚合后其抗性表现。
Pm21已经被转育到栽培品种并在生产中应用，尽管Pm21的抗性目前非常突出，但长期大范围的使用必会使它面临强大的寄主选择压力。Wianiewska等经过5年的田间试验证实小麦抗病基因会逐渐丧失抗性，而聚合品种的抗性更容易持久保持。因此挖掘利用小麦的抗病基因聚合是解决小麦抗源单一化问题的有效途径，是缓解生产上缺乏抗病品种的缺乏困境的有效方法。
三、实验研究的目标
本研究致力于应用分子标记技术对已知的小麦抗白粉病基因进行聚合后的抗性表现进行评价，以期发现具有良好抗性的组合。为后来者进行抗病育种打下良好的基础。 四、实验研究的基本内容
1、对我国已发现的抗病基因进行评价和选择
Pm1、Pm3a、Pm3b、Pm3c、Pm3f、Pm5、Pm7、Pm8等抗病基因已在中国丧失抗性.其中Pm8曾经在中国的应用最为广泛，但由于与之相适应的致病性小种频率迅速上升，导致其抗性很快丧失 ；虽然Pm4a在中国大部分地区仍然保持较高的抗性，但小麦自粉菌对其毒性呈较快的上升趋势，特别是在西南地区，Pm4a正逐步丧失抗性，因此在生产上应该慎用。Pm9没有单独的载体，往往与Pm1、Pm2共存于一个品种中，但含Pm1+Pm2+Pm9的Normindie对中国小麦白粉病生理小种不具备抗性。PmlO-Pm37是近年引进或创造出的新抗源，其中PmlO、Pmll、Pml4、Pml5只对冰草属白粉病菌表现抗性，而不抗小麦白粉病菌，在小麦抗病育种中无实际利用价值。Pml7抗谱狭窄，Pml9对中国白粉病生理小种基本不具有抗性，不能在育种中进行应用。在强毒力小种E20出现以后，只有Pml2、Pml6,Pm20、Pm21、Pm30、Pm31、Pm33等基因表现出抗性。含有Pml2、Pml3、Pml8、Pm20的品种(系)农艺性状差，不宜直接用作育种亲本。Pm23由杨足君和任正隆发现，Pro24来源于中国的农家品种Chiyacao，这两个基因已经在育种中广泛应用。而Pro30,Pm31、Pm32、Pro34、Pro35,Pm36和Pm43在中国利用价值还有待于进一步鉴定。由南京农大发现并鉴定的Pm21是目前已知抗白粉病基因中最好的抗病基因，其载体品种无明显的不良性状，在不同小麦遗传背景下抗病性均表现稳定，经国内外20余个单位鉴定，含Pm21的易位系抗目前国内所有的白粉病菌株及检测过的120个欧洲生理小种，是目前世界上抗谱最广、抗性最稳定的白粉病抗性基因。
基于上述评价我们选择以Pm21作为背景抗性基因，与Pm10——Pm43多种抗病基因进行聚合。
2、不同基因的来源：
① 源于四倍体栽培小麦(timopheevii 2tr=28，AAGG)Pm27、Pm37。
② 源于拟斯卑尔脱山羊草（Speltoides 2n=14，SS或BB)的Pm1d、 Pml2、Pm32。 ③ 源于高大山羊草(Ae．Longissima 2n=14，ss)的Pml3。
④ 源于二倍体粗山羊草(Ae．tauschii2tr=14，DD)，山羊草属与小麦属遗传关系最近，其染色体组D是普通小麦染色体组的供体。
⑤ 源于黑麦(Secale cereale 2n=14）Pm17、Pm20。 ⑥ 源于簇毛麦(Hylandia2n=14，vv)的Pro21
⑦ 源于卵穗山羊草(Aegilopsovata，2n=28，UUMM)的Pm29 。
⑧ 源于中间偃麦草(Thinopyrumintermedium2n=42，EEEEStSt或JJJsJsSS)的Pm40、Pm43。
⑨ 源于普通小麦PmlO、Pmll、Pml4、Pml5、Pm23、Pm24、Pm28、Pm38、Pm39 ⑩ 源于野生一粒小麦Pm25。
11 源于野生二粒小麦Pml6、Pm26、Pm30、Pm31、Pm33、Pm41、Pm42。
12 波斯小麦Pm36
五、实验研究的技术路线和步骤
1、实验材料的创制
通过远缘杂交、外源抗病基因追踪、携有外源抗病基因的染色体和染色体片段的分子、细胞遗传学鉴定和染色体操纵技术，将簇毛麦的抗白粉病基因Pm 21、以及其它材料的抗性基因转入栽培小麦
2、抗性鉴定
将材料种植于每穴4 cmx4 cm 的72穴长方形穴盘中。除开抗病亲本外，在盘中随机种植苏麦3号和感病亲本作为感病对照。一叶期用生理小种Bgt19接种(Yao et a1．，2007)。分别于2004年和2005年秋季在同一个生长室进行F 和F 家系的鉴定。鉴定时每天提供14 h光照，22℃／18℃昼夜温度。接种后9 d进行抗病性调查。这时感病对照已出现明显病征，但抗病对照还未发病。用0～4级表示发病严重度，它们分别代表没有可见病症、叶片上具有坏死斑但不产生孢子、少量产孢、中量产孢、大量产孢。在 家系抗性鉴定中每家系所用植株数为27～36株，取单株的加权平均发病严重度代表家系的抗性等级。
侵染型(ITS)按0—4级标准记载，标准为： 0级：免疫，植株无可见病斑，无侵染症状；
1级：高抗，有坏死病斑，病斑小，倒四叶菌丝小而少，菌丝层稀薄可见绿色叶面，偶
见较大病斑，但仍透绿，产孢量极少；
2级：中抗，有坏死病斑，中等的孢子堆形成，倒三叶、倒二叶感病，叶片病斑直径小
于lmm，下部叶片菌丝少而薄；
3级：中感，无坏死反应病斑，旗叶感病，叶片病斑多，但病斑不连片，直径大于lmm，
下部叶片菌丝大而厚；
4级：高感，无坏死反应病斑，穗部或旗叶感病，叶片病斑直径一般大于lmm，菌丝层
厚，产孢量多，病斑连片。
反应型按照以上标准分成两类，即抗病单株(R)(IT=0-2)和感病单株(IT=3和4) 3、标记分析
3.1基因组DNA的提取
DNA的提取参照Sharp(1989)的提取方法，有改动。
(1)用1．5ml离心管取新鲜嫩叶少许，打开盖子后慢慢放入液氮中冷冻，用磨样器迅速研磨成粉末，加入预热的“S”缓冲液600111混匀，650C水浴1．2小时，水浴过程中轻摇数次，充分混匀。
(2)加入等体积的酚．氯仿(V／V=I：1)，充分混匀以除去提取液中所含的蛋白质(不停轻轻摇动10．15分钟)，12000rpm离心10．15分钟；将上清液移入另一1．5ml离心管中并加入等体积的氯仿，以除去过量的苯酚，充分混合后12000rpm离心10分钟：
(3)将上清液移入另一离心管中，加入0．6体积的异丙醇(或2倍体积的乙醇)，轻轻混匀，静置10分钟，勾出DNA沉淀用70％的乙醇浸洗2．3次，于离心管中室温干燥。(如果DNA看不到很大的絮状沉淀，可以沉淀充分以后直接离心，8000rpm离心6分钟，再用70％的乙醇浸洗)。
(4)当乙醇挥发除净以后，将DNA溶于200}tl 1xTE(pH7．O)中备用，或者直接以沉淀形式冷冻保存于．200C冰箱。如果提取的DNA需要进一步的纯化，则需加入6001xl l xTE(pH7．O)进行溶解，溶解后加入3-51．tl RNAase(10mg／m1)，370C水浴保温1小时，然后进行以下各部的操作。
(5)加入等体积的酚．氯仿，混匀后12000rpm离心10．15分钟，上清液移入另一离心管中，加入等体积的氯仿，混匀后12000rpm离心10分钟。
(6)取上清液加入1／10体积的3M的醋酸钠混匀，加入2倍体积的冷无水乙醇，混匀后低温静置10分钟，挑出DNA沉淀，用70％乙醇浸洗2．3次，待DNA干燥后加入50 islxTE(pH7．O)。
3.2 SSR标记分析 3.2.1 SSR引物
定位在5A(92 SSRs)和2AL(76 SSRs)上的小麦SSR引物被用来筛选亲本Chancellor和Line 81．7241的多态性。这些引物分成两种类型：一种是Genomic．SSRs，包括GWM(R6der et a1．，1998a)、GDM(Pestsova et a1．，2000)、WMC(Gupta et a1．，2002)、BARC(Song et a1．，2002，2005)、CFA、CFD(Sourdille et a1．，2003；Guyomarc’het a1．，2002)、PSP(Byran et a1．，1997；Stephenson et a1．，1998)；另一种为EST-SSRs，包括CFE(Zhang et a1．，2005)、CWEM(Peng et a1．，2005)、DuPw(Eujayl et a1．，2002)、KSUM，CNL(Yu et a1．，2004)和SWES(Chen et a1．，2005)。相关序列及最佳复性温度等信息可参考GrainGenes website(http：//wheat.pw.usda.gov)及相应参考文献。
3.2.2 PCR反应体系
SSR-PCR反应体系如下：
3.2.3 SSR扩增程序
扩增反应在TakaRa PCR thermal cycler或者Bio-Rad 9600 thermal cycler上进行，使用降落PCR(Touchdown PCR)，即940C变性4 min，接着15个循环的复性温度降落程序，每个循环940C变性45 s，650C复性50 s(．oC／循环)和720C延伸55 s；最后30个循环的普通PCR程序即：940C变性40 s，500C复性40 s，720C延伸40 s，最后72*(2延伸5 min，扩增结束后100C保存。
3.2.4扩增产物的检测
扩增产物加入适量的溴酚兰(产物和溴酚兰体积比5：1)，混匀，在6％聚丙烯酰胺非变性凝胶(39：1)上稳压120V电泳，银染显色，然后用Tanon Gis．2010型凝胶成像系统照相观察。
3.2.5硝酸银染色步骤
(1)电泳完毕，取下胶块在固定液中固定3分钟。 (2)用去离子水快速冲洗2．3次，每次30．40秒。 (3)于银染液中染色5．7分钟。
(4)用水快速冲洗(10秒钟左右)，不超过20秒钟。如果上一步所用银染液为首次使用，可以多洗一次。
(5)放入显影液中显影至扩增带出现(一般以Marker出现，颜色不再加深为止)。 (6)最后放入停影液中停影，一般用去离子水代替即可。 4、结果分析
对单株进行PCR扩增和基因型检测后。根据结果寻找表现型(抗感性状)和基因型(扩增带型)基本一致的Marker，进一步在大的分离群体中进行验证，计算标记与基因之间连锁遗传距离(标准是在优选小群体中估算的遗传重组率低于40％)。记录高抗样本的基因性，找到其中的对应关系。
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