中药龟甲胶的质量控制方法研究
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刘琳 ，张贵锋 *，查圣华 ，孔英俊 ，高建萍 ，王明林 ，
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张宏 ，苏志国
（1．山东农业大学 食品科学与工程学院，山东 泰安 271018； 2．中科院过程工程研究所，北京 100190；
3．同仁堂健康药业股份有限公司，北京 100022）
[摘要] 目的：研究龟甲胶酶产物的多肽组成，探索基于特征多肽的龟甲胶质量控制方法；方法：利用液质 联用技术结合酶解技术，比较龟甲胶和牛明胶酶解产物的多肽组成，筛选差异性多肽；结果：龟甲胶酶解 产物中检测出特征多肽，其对应离子分别为 m/z 856.0 和 m/z 732.7，而牛明胶中检测出的多肽(m/z 727.8 和 m/z 782.5)在龟甲胶酶解产物中未检测出。结论：龟甲胶和牛明胶酶解产物存在差异性多肽，基于特征多肽 或特征离子的龟甲胶质量控制方法具有可行性。
[关键词] 龟甲胶；质量控制；牛明胶；特征多肽；液质联用
龟甲胶是龟甲经过漂泡、煎煮和浓缩等处理并添加辅料制成的固体胶，其功效包括滋 阴潜阳、益肾强骨和养血补心等。龟甲胶主要成分为可溶性胶原蛋白及其降解产物[1-3]。近 年来随着龟甲胶等胶类中药的需求量不断上升，市场上出现了掺加牛皮胶甚至皮革降解物伪 品龟甲胶，其有效功效较低甚至产生毒副作用。研究龟甲胶中蛋白质或多肽组成并筛选特征 性多肽不仅有利于龟甲胶质量控制，而且有利于建立相应的真伪鉴别方法。
张思巨[4]等采用 IR、UV、TCL 和 HPLC 等技术研究了龟甲胶、鹿角胶和阿胶的理化性 质并尝试用于三种胶的鉴别，但由于不同动物胶的宏观性质相似，采用这些方法难以获得有 显著差异的信息。李春梅[5]等人利用 SELDI-TOF MS 分析了龟甲胶的蛋白质组成，但未比较 不同动物胶的蛋白质或多肽组成差异。其它方法如示差扫描量热法[6]、等电聚焦电泳法[7]和 圆二色谱法[8]等也曾尝试用于胶类中药的鉴别。由于胶类中药制备过程中需添加辅料且不同 厂家使用的辅料存在差异，龟甲胶在成分、分子量范围和光谱特性等性质不稳定。
龟甲胶中存在大量的胶原蛋白降解物，不同动物来源的胶原蛋白其氨基酸序列会存在 差异[9]，这些差异可作为区分不同动物胶原或明胶的依据[9,10]。本研究拟采用 HPLC-MS 结 合蛋白酶切技术比较龟甲胶和牛皮胶酶解产物中的多肽组成差异，筛选特征离子或特征多 肽，探索一种基于特征多肽的龟甲胶质量控制方法。 1 材料与方法 1.1 样品来源
龟甲胶购自北京同仁堂药店；牛明胶购自美国 Sigma 公司。 1.2 仪器与试剂
胰蛋白酶(序列纯)购自美国 Promega 公司；牛 I 型明胶购自美国 Sigma 公司， 2,4-二硝 基氟苯(DNFB)购自 Acros Organics 公司，其他试剂均为市售分析纯。液质联用系统由 Agilent 1100 HPLC 和 Thermo 公司 LCQ DecaXP 质谱组成，数据采集与处理软件分别为 Xcalibur1.3 和 Biowroks3.1。
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1.3 实验方法 1.3.1 样品处理
称取 1 g 研磨后的龟甲胶样品，加入 20 mL 水，50℃水浴溶解，室温 10 000 r· min-1 离 心 15 min，取清液加入 20%饱和三氯乙酸，4℃保存 10 min，10 000 r· min-1 离心 15 min，收 集上清液和沉淀物。将沉淀物重新溶解于水中，调 pH8.0，加入 100 μL 胰蛋白酶 37℃酶解 12 h，采用 HPLC-MS 分析其多肽组成。 1.3.2 分析方法
1.3.2.1 凝胶过滤色谱分析 色谱柱 TSK G3000SWxL(7.8×30 cm, 5 μm)；流动相 0.02 mol· L-1 磷酸缓冲液(pH7.0)；流速 0.5 mL· min-1；进样量 20 μL；紫外检测波长 214 nm。
1.3.2.2 氨基酸组成分析 样品水解、DNFB 法氨基酸衍生和液相条件分析条件参照文献[11]。 1.3.2.3 高效液相色谱质谱联用分析 色谱柱 ZORBAX SB-C18(2.1×150 mm, 5 μm)；流动相： 水(0.1%TFA)(A), 乙腈(0.1%TFA)(B)；梯度 0~100 min，5%~40%B；100~120 min，40%~70%B； 进样量样品 20 μL；流速 0.2 mL· min-1。质谱条件喷雾电压 4.5 kV；毛细管温度为 300℃； 鞘气(N2)60 个单位；正离子模式，一级质谱扫描范围 m/z300~900,精确质量数扫描(Zoomscan) 和二级质谱(MS/MS)扫描均为数据依赖型扫描(Data Dependent Scan)；动态排除次数 1；动态 排除时间 0.5 min；二级质谱碰撞能量 35%，上述质谱条件中扫描范围更改为 m/z 900~1 400 和 1 400~2 000，重复进样。
1.3.2.4 数据处理 从 UniProtKB/Swiss-Prot 数据库中提取全部胶原蛋白序列的数据库。将质 谱数据使用 Biowork 软件中 Turbosequest 进行数据库检索，检索结果过滤参数：Xcorr≥1.5， DeltaCn≥0.1，二级质谱离子数量>15，并综合考虑目标离子色谱峰的信噪比及二级质谱图中 b、y 离子匹配性和连续性。 2 结果
2.1 凝胶过滤色谱分析 龟甲胶样品溶解后经离心处理形成上下两层，上次呈乳白色粘稠状，
下层为澄清透明的
溶液。有研究报道龟甲胶中主要包含蛋白质和多肽类、多糖类和脂类物质[11,12]，样品溶液经 离心后分成的两层中上层主要为脂类物质，多糖和蛋白质及多肽类物质分布在下层溶液，图 1A 是下层溶液的凝胶过滤色谱图。下层溶液经 TCA 处理后出现沉淀物，实验采用凝胶过滤 色谱对上清液和重新溶解的沉淀物进行了分析。图 1B 是下层沉淀物重新溶解后的凝胶过滤 分析结果，表明样品溶解经 TCA 沉淀后下层沉淀物具有较高的分子量分布，沉淀物经考马 斯亮蓝法分析的结果表明沉淀物主要是蛋白类物质。上清液中的组分平均分子量较低，在保 留时间 13~20 min 范围内未检测分子量较高的组分(图 1C)。由于糖类物质在 TCA 溶液中可 溶解，因此，TCA 沉淀处理后样品中的多糖类物质主要存在于上清液。考马斯亮蓝法分析 结果表明上清液中存在少量蛋白或多肽类物质，但平均分子量较低，应属于胶原蛋白降解后 的低分子量多肽类物质。
实验将沉淀物充分洗涤后进行了酶解处理，图 1D 是酶解产物的凝胶过滤分析结果，表 明沉淀物的酶解液保留时间主要集中在 29 min 左右，比图 1B 保留时间 13.5 min 明显延后， 说明龟甲胶中蛋白质被酶解成分子质量较小的多肽片段。 2.2 氨基酸组成分析
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为研究龟甲胶中蛋白质的性质，实验首先将经过 TCA 处理后的沉淀物进行了水解，采 用 DNFB 法衍生后采用 HPLC 进行了氨基酸组成分析。图 2 是样品的氨基酸组成分析 HPLC 图谱，氨基酸组成分析结果见表 1，结果表明龟甲胶含有胶原蛋白特有的羟脯氨酸，含量约 占总氨基酸含量的 10%，与脯氨酸之和约占 20%，甘氨酸含量约占 32.5%，未检出蛋氨酸和 半胱氨酸，这种氨基酸组成与胶原蛋白的氨基酸组成特征较为一致，说明龟甲胶中主要蛋白 质是胶原蛋白。样品中甘氨酸含量低于 33%(胶原蛋白核心序列氨基酸组成特征)，表明龟甲 胶中也存在少量的非胶原类蛋白质或多肽[13]。
A．龟甲胶溶解并离心后的清液；B．龟甲胶溶液离心后的清液经过 TCA 处理后的沉淀物；C．龟甲胶溶 液离心后的清液经过 TCA 处理后的上清液；D．龟甲胶溶液离心后的清液经过 TCA 处理后的沉淀物酶解
产物
图 1 龟甲胶的凝胶过滤谱图
图 2 龟甲胶氨基酸组成分析 HPLC 图
表 1 氨基酸组成分析表
氨基酸 天冬氨酸 谷氨酸 羟脯氨酸 丝氨酸 苏氨酸 甘氨酸 脯氨酸 精氨酸
含量* 63 103 99 32 16 325 109 53
氨基酸 丙氨酸 缬氨酸 异亮氨酸 亮氨酸 苯丙氨酸 组氨酸 赖氨酸 酪氨酸
含量* 95 22 15 28 10 3 24 4
注：*龟甲胶中氨基酸含量以每 1000 个氨基酸残基中的氨基酸的比例计算
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