欧阳术创编 2021.02.02 欧阳美创编 2021.02.02
CRISPR/Cas9基因敲除原理及其应用
时间:2021.02.02 创作:欧阳术 CRISPR(clustered,regularlyinterspaced,shortpalindromicrepeats)是一种来自细菌降解
入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中,CRISPR系统共分成3类,其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白(Cas蛋白)共同发挥作用,而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可,这为其能够广泛应用提供了便利条件[1]。
目前,来自Streptococcuspyogenes的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9蛋白(含有两个核酸酶结构域,可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物,然后通过PAM序列结合并侵入DNA,形成RNA-DNA复合结构,进而对目的DNA双链进行切割,使DNA双链断裂。 由于PAM序列结构简单(5’-NGG-3’),几乎可以在所有的基因中找到大量靶点,因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞,是目前最高效的基因组编辑系统[1]。
通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造,将其连接
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在一起得到sgRNA(singleguideRNA)。融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力,但因为结构得到了简化更方便研究者使用。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接,得到可以同时表达两者的质粒,将其转染细胞,便能够对目的基因进行操作[2,3]。
目前常用的CAS9研究方法是通过普通质粒,质粒构建流程如下:
Cas9质粒构建 pGK1.1
设计2条单链oligo序列;退火形成双链DNA 将双链DNA连接到载体中
转化G10competentcell筛选阳性克隆;测序验证序列;质粒大提;电转染靶细胞
在细胞内crRNA识别靶位点,Cas9对靶位点进行随机剪切 CruiserTM酶切细胞池,计算突变率;CruiserTM酶切初筛阳性克隆;将阳性克隆测序验证;做敲除序列比对分析。
目前常见的CAS9普通质粒有(汉恒生物提供cas9质粒试剂盒):
虽然普通质粒很多时候也能达到实验效果,但是质粒转染具有效率低,作用时间短暂性等缺点。病毒的出现解决了质粒这些问题,常用的病毒主要有慢病毒和腺病毒,慢病毒常用质粒见addgene(lentiCRISPRv2,lentiGuide-Puro,lentiCas9-Blast),
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慢病毒可以整合入宿主基因组中,长期稳定的表达(汉恒生物提供CRISPR/cas9慢病毒包装),但是由于慢病毒克隆能力有限而CAS9本身分子量比较大(大于4kb),且长期插入可能导致乱切,脱靶等,同时慢病毒包装最终获得的滴度不高等原因,腺病毒更有优势,腺病毒克隆能力强,获得的病毒滴度也高。同时相对于普通质粒来说,作用是时间也比较长,可以达到更理想的敲除效果。(汉恒生物提供CRISPR/cas9腺病毒包装)
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CRISPRCas9基因敲除原理及其应用之欧阳术创编
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