第六章 微生物的生长与环境条件

第六章 微生物的生长与环境条件

第六章 微生物的生长与环境条件

微生物的生长与环境条件的关系极为密切。只有当外界供给适当营养物质，满足微生物对各种物理、化学因子的要求之后，微生物才能正常生长，而不良的环境条件则导致微生物停止生长，变异或死亡。

在高等动植物中，生长和繁殖是两个完全不同而且易于区分的概念。在适宜的环境条件下，生物个体的增大谓之生长，而个体数量的增加谓之繁殖。 线状微生物（如真菌）的生长表现为菌丝体的分枝和伸长。繁殖表现为产生孢子，孢子脱离母体菌丝后，再萌发产生子代菌丝体。

单细胞微生物也有个体生长和细胞分裂繁殖这两个过程。细胞的体积逐渐增大，这就是生长。个体数目增加，这就是繁殖。但在实际工作中，由于研究单个微生物（如细菌、古菌）细胞的生长既十分困难又无必要。因此，微生物的生长主要是指微生物群体中个体数量或质量的增长，它实际上包括了生长和繁殖这两个既有联系又互相区别的概念。单细胞微生物生长是通过繁殖而表现出来的，以群体数目的增加为标志。

第一节、微生物的生长和测定方法 （一）、微生物生长的定义

微生物生长是与细胞内生理代谢活性紧密联系的，有人估计，细菌细胞生长的合成过程大约包含了 2000 多个各种化学反应。因此，代谢活性也可以作为衡量微生物生长情况的一个指标。生长的概念应是在合适的外界环境条件下，微生物个体或群体细胞中主要化学组分的协调而平衡的增长。也就是说，微生物在生长过程中应保持恒定的细胞化学组成，细胞内的 DNA 、蛋白质、多糖和类脂等主要成分应协调增长；生长的外部表现为个体数量的增加和群体生物量（biomass）的增长。生物量是指一种生物单位体积的重量，多以克为单位。 （二）、微生物生长的测定方法 1、细胞总数的测定

测定液体培养基中细菌总数，包括活的和已丧失生活能力的细菌。

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（1）显微镜直接计数法 本法仅适用于细菌等单细胞的微生物类群。测定时需用细菌计数器（Petroff-Hausser counter，适用于细菌）或血球计数板（适用于酵母、真菌孢子等）。在普通光学显微镜或相差显微镜下，直接观察并记下一定体积中的平均细胞数，然后换算出供测样品的细胞数。 本法的优点是快捷简便、容易操作；

缺点是不能区分死活细胞，以及形状与微生物相似的颗粒性杂质。 （2）比浊法 这是测定菌悬液中细胞总数的快速方法。原理是菌悬液中细胞数量越多，浊度越大，在一定浓度范围内，悬液中的细菌细胞浓度与光密度（OD值）成正比，同透光度成反比。

由于细菌细胞浓度仅在一定范围内与光密度成直线关系，因此待测菌悬液细胞浓度不宜过低或过高。培养液的颜色不宜过深，因颗粒性杂质也会干扰测定结果。本法常用于跟踪观察培养过程中细菌数目的生长情况，如细菌生长曲线的测定和工业生产上发酵罐中的细菌生长情况等。

2、活细菌数量的测定 此法是测定具有繁殖能力的细菌数量。

（1）稀释平皿测数法 在理论上可以认为，在高度稀释条件下，微生物细胞充分分散，呈单个细胞存在。每一个活的单细胞均能繁殖形成一个菌落，因而可以用平皿培养的方法使每个活细胞生长并形成一个单独的菌落，通过统计长出的菌落数来推算待测样品中的活菌数。具体做法像稀释平皿分离法一样，先将待测样品作一系列倍比稀释，将定量的稀释液接种于琼脂培养基，作平皿培养。根据平皿上出现的菌落数，便可推算出待测样品中活菌数方法是迄今仍广泛采用的主要活菌计数方法之一。缺点是由于供试培养基和实验条件的限制，在混合微生物样品中，并非所有细菌都能形成肉眼可见的菌落。而且在实际操作中难以做到使所有细胞完全分开，不能保证每个菌落都是由单个细胞分裂而来，所以现在倾向于用菌落形成单位（colony forming units, CFU）表示样品中活细菌数量。本法又分为倾注平板法（pour plate method）和涂布平板法（spread plate method）两种。

（2）最大概率法（most probable number, MPN） 将待测样品在定量培养液中作一系列稀释培养。在一定稀释度数以前的培养液中出现细菌生长，而在这个稀释度以后的培养液中不出现细菌生长。将最后3级有菌生长的稀释度称为临界

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级数，以3~5次重复的3个临界级数求得最大概率数（MPN），可以计算出样品单位体积中细菌数的近似值。

稀释度 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 重复数 5 5 5 5 5 5 出现生长的管数 5 5 5 4 1 0

根据上述结果，其数量指标为“541”，查统计分配表（表8-1），得到近似值为17。乘以第一位数的稀释倍数105，则原菌液中的活菌数=17x105。即每毫升原菌液中含活菌数1.7x106个。本方法特别适合于含菌量少的样品或一些在固体培养基上不易生长的细菌样品的测数，特点是利用微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类微生物的存在和丰度。如测定土壤微生物中特定生理群（如能进行氨化、硝化、纤维素分解、自生固氮、根瘤菌、硫化和反硫化细菌等）的数量和检测污水、牛奶及其他食品中特殊微生和类群的细菌数量。其缺点是只能进行特殊生理群的测定，结果也较粗放。

（3）浓缩法（滤膜法） 对于测定象空气、水等体积大而且含菌浓度较低的样品中的活菌数，富集，培养，最后可根据菌落数推算出样品的含菌数。 3、细胞生物量的测定 主要有4种方法。

（1）测定细胞干重法 将单位体积的液体培养基中培养的微生物，经过滤或离心收集菌体细胞，用水洗净附在细胞表面的残留培养基。在105℃高温或真空下干燥至恒重，称重，即可求得培养物中的总生物量。一般细菌干重约为湿重的20%，本法适用于含菌量高、不含或少含颗粒性杂质的样品。一般每1mg细菌干重约等于4~5mg湿菌鲜重和相当于4~5×109个细胞。

（2）DNA含量测定法 微生物细胞的DNA含量较为恒定，不易受菌龄和环境因素的影响。DNA可与DABA-HCl（3，5-二氨基苯甲酸-盐酸）溶液反应，显示特殊的荧光，根据这种荧光反应强度求得DNA含量。它可以反映待测样品中所含的生物量，也可以根据DNA含量计算出细菌数量。有人推算，平均每个细菌细胞约含8.4x10-5ng DNA。该法的优点是结果准确，缺点是比较费时费事

（3）ATP含量测定法 微生物细胞中都含有相对恒定量的ATP，而ATP与生物量之间有一定的比例关系。用适当的试剂从培养物中提取出ATP，以分光光度计

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