SRT计划项目申请书
项目名称: 茶树CBF基因启动子的克隆及其序列分析 申请者: 危峰拥亭 学 院: 园艺学院 专 业: 园艺专业
2009年 4 月 30 日 南京农业大学教务处制
指导教师: 房婉萍 职称: 副教授
一、简表
申请人姓名 年 级 项目名称 项目来源 项目类型 经费来源 经费额度 指导教师 姓 名 参加人 姓 名 x x X 二年级 学 号 电 话 1418329 x 班 级 E-mail 园艺83班 x 茶树CBF基因启动子的克隆及其序列分析 A、 自立项目 B、√教师科研课题的子项目 C、其它 A、√实验研究 B、调查研究 C、软件制作 A、√国家资助 B、学校资助 C、导师课题资助 1000元 房婉萍 学 院 园 艺 园 艺 指导教师职称 班级 园艺81 园艺82 副 教 授 合作者签名 学号 1418129 1418213 申请时间 2010年4月30 日 完成时间 2010 年6月30日 项目研究 内容 摘 要 以茶树（Camellia Sinensis）抗寒种质“苏茶早”新梢为材料，利用SEFA-PCR方法，克隆得到茶树CBF基因的启动子序列，对克隆序列进行分析比对，探讨所得片段与近缘物种CBF基因启动子的同源性，利用softberry网站的Recognition of Regulatory motifs with statistic数据库分析所克隆得到的CsCBF基因启动子序列，揭示所得片段的可信度与准确性，对茶树种质资源的开发利用和茶树的引种以及寻求提高茶树抗寒性栽培技术等都具有十分重要的理论和实践意义。 1
二、立论依据 1.研究意义 温度是限制茶树地理分布和生长发育的主要环境因子之一，低温胁迫经常造成茶树的寒害（冷害和冻害），并给茶的生产带来严重损失[1]。因此，对茶树抗低温冷冻机理的研究不仅是一个基础理论的研究课题，更是一个具有潜在应用价值的课题。培育耐低温茶树品种是一条减少寒害造成损失的根本途径[2-4]。由于茶树生长周期过长，严重影响传统的抗寒育种方法的步伐。二十世纪七十年代发展起来的植物基因工程给茶树耐低温遗传改良带来了新的曙光[5]。所以，鉴定和筛选茶树中的抗寒基因资源就变的越来越重要。 茶树CBF基因启动子若被被克隆和鉴定，并提出低温信号转导以及调控路径的模型，就能为采用基因工程手段进行植物抗寒育种及有关生理的研究提供了新的启示[6]。研究茶树的抗寒性，对茶树种质资源的开发利用和茶树的引种以及寻求提高茶树抗寒性栽培技术等都具有十分重要的理论和实践意义。 2.研究现状分析 2.1植物冷相关基因及其调控途径的研究进展 低温寒害经常对植物造成伤害并影响作物产量，限制了植物地理分布和生长发育。长期以来，人们从生理学、形态学、生物化学、生物物理学等多个方面对植物抗寒机制进行了广泛的研究[7]。在综合应用分子遗传学及生物信息学手段下，大量冷诱导基因被检测或被分离出来，其中有些被实验证明对提高植物的抗寒性有着重要作用[8]；同时，对冷驯化过程中的基因表达调控进行了深入的探索，初步提出低温信号转导以及调控途径的模型，从而揭示了冷诱导基因表达调控的复杂性与多样性。 植物在长期的进化过程中，演变产生了多种多样的耐逆机制。在低温环境胁迫下，植物体内会有多种基因诱导表达并发生一系列的生理生化变化，从而使植物对这些胁迫作出抵御的反应。冷胁迫诱导表达的基因产物按其作用可分成两大类，一类产物直接保护细胞免受环境胁迫的伤害，如LEA蛋白、抗冻蛋白、伴侣蛋白、脂肪酸去饱和酶和脂肪迁移蛋白等功能蛋白，为各种渗透保护剂的生物合成所需的酶 2
以及清除活性氧自由基的解毒酶等；另一类产物包括转录因子、蛋白激酶和与磷酸肌醇代谢有关的酶，它们在调控基因表达、感应和转导胁迫信号中起重要作用[9,10]。随着拟南芥冷应答调控网络图谱的绘制成功，对冷诱导基因及其调控关系的深入研究，不仅使我们在分子水平上深入理解植物的抗寒机制，而且为人们通过基因工程手段进行植物抗寒育种提供了新的理论依据和新的策略[11,12]。 2.2植物基因启动子的结构和功能 通过对多种基因启动子序列比较分析，发现绝大多数基因的启动子都具有共同的结构特征，大部分植物基因多数情况下转录起点为A(腺嘌呤)，且两侧多为嘧啶碱基[13]，在-25～-30bP处含有TATA序列，-70～-78bP处有CAAT区出现，-80～-110bp区含有GC盒。习惯上将TATA区上游的保守序列称为上游启动子元件(UPE)，这些特定序列和结构共同作用确保转录精确而有效地起始。真核生物基因启动子的典型核心结构大约在转录起点-40～+50之间，具有结合并控制转录起始前复合物的装配、定位转录起始位点并控制转录的方向、对细胞内临近或远处的激活子或抑制子做出响应的功能[14]，由RNA聚合酶Ⅱ指导转录的基因核心启动子大多包含一个TATA盒和(或)起始子TATA盒在转录起始位点的32 ± 7个核营酸处，保守序列为TCACTATATATAG，即TATAAA序列[15]，一般被认为参与决定转录的方向，并在依赖于RNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ的启动子内起作用。起始因子(Inr)是基因启动子核心结构的第2种类型，与转录起始位点相重叠[16]，一致序列为PyPyANT /ApyPy，其功能与TATA盒相似，能指导转录起始前复合物的装配、决定转录起始位点并调节上游激活蛋白的活性。启动子进化成许多结构形式可能是转录调控中的特殊需要，一个给定的基因，其特异核心启动子可能在转录调控中起作用。并非任何细胞型特异的蛋白在任何情况下都起作用，而是取决于这种启动子提供一个合适的环境来决定基因是被激活还是被抑制[17]。 2.3 抗寒基因CBF启动子的研究 低温是植物所面临的重要逆境因子，植物抗寒基因研究是目前植物抗逆性研究的一个热点。目前，植物在低温反应过程中有两种主要途径：其一，依赖ABA途径，包括ABA应答元件和带有b-zip基序（motif）的ABA应答元件结合蛋白；其二，非依赖ABA途径，CRT/DRC (C-repeat / dehydration-responsive element)和CBF1(CRT 3
/DRE-binding factor l)是这一途径中的重要元件。这条途径具体为：CBF转录因子→CRT/DRE基序→COR基因表达→植物抗寒性增加，在低温信号传递过程中，CBF是感受上游信号并将外界低温信号向下游传递的重要信号传递体[18]。植物低温抗性的分子机理从研究植物冷驯化过程中基因表达发生的变化开始至今，已从拟南芥、油菜、菠菜、马铃薯、小麦、大麦等植物中鉴定出大量冷诱导基因。近几年来，玉米、番茄等冷敏植物也克隆到CBF类似基因，关于它们的研究及其在抗低温品种改良中的应用也倍受重视[19]。本研究利用 SEFA-PCR方法对其在低温处理过程中的表达特性进行了分析[20,21]，旨在为进一步研究茶树抗寒分子机制奠定基础。 参考文献 [1] 江福英,李延,翁伯琦.植物低温胁迫及其抗性生理[J].福建农业学报,2002,17(3):190~195. [2] 韦朝领,李叶云,江昌俊.茶树逆境生理及其分子生物学研究进展[J].安徽农业大学学报,2009,36(3):335~339. [3] 罗军武,沈程文,施兆鹏,等.茶树基因组DNA提取纯化技术研究[J].茶叶通讯,2002,4:20~24. [4] Jaglo K R,Kleff S,Amundsen K L,et al.Components of the Arabidopsis c-repeat/dehydration responsive element binding factor cold-response pathway are conserved in Brassica napus and other plant species[J].Plant Physiol,2001,127:910~917. [5] Wachira F . N. Characterization and estimation of genetic relatedness among heterogeneous population of commercial tea clones by random amplification of genomic DNA sample[J].Tea,1997,18(1):11~20. [6] 邹中伟,房婉萍,张定,等.低温胁迫下茶树基因表达的差异分析[J].茶叶科学,2008,28(4):249~254. [7] 简令成.植物抗寒机理的研究进展[J].植物学通报,1992,9:17~22. [8] 房婉萍,邹中伟,侯喜林等.茶树冷胁迫诱导H1~histone基因的克隆与序列分析[J].西北植物学报,2009,29(8):1514~1519. [9] Thomshow MF. Molecular genetics of cold acclimation in higher plants [J]. Adv Genet, 1990,28:99~131. [10] Thomashow MF. Plant cold acclimation: Freezing tolerance genes and regulatory mechanisms[J]. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol ,1999,50:571~599. 4
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