硅藻COX-Ⅰ区种属特异性PCR用于法医学溺死诊断
通讯作者:刘宝琴，E-mail: qinqin0508@126.com
【摘 要】【摘要】目的:对KEint2F和KEintR这一对COX-Ⅰ区特异性PCR引物应用于法医学溺死诊断的有效性进行研究。方法:取12例溺死尸体和5例非水中尸体的肺、肝组织，以及取落水区域水样及双蒸水，通过硝酸消化镜检法(镜检法)和种属特异性PCR检验法(PCR法)两种方法进行硅藻检验，对其硅藻的检出率进行对比。结果: PCR法比镜检法具有更高的硅藻检出率。结论: KEint2F和KEintR可作为法医学硅藻检验的特异性PCR引物用于法医学溺死的诊断。
【期刊名称】川北医学院学报 【年(卷),期】2015(000)001 【总页数】4
【关键词】【关键词】法医病理学;溺水; COX-Ⅰ;聚合酶链反应;硝酸消化法;硅藻 【文献来源】https://www.zhangqiaokeyan.com/academic-journal-cn_journal-north-sichuan-medical-college_thesis/0201243597810.html
邓建强1，刘宝琴2，龙仁1，梁安文1，李文慧1，蔡继峰3
(1.海南医学院法医鉴定中心;2.海南医学院附属医院生殖医学中心，海南海口 570102;3.中南大学湘雅医学院法医学系，湖南长沙 410078)
在法医学实践中，判断水中尸体是否为生前溺水死亡对案件的定性至关重要，但水中尸体发现时往往已经高度腐败，很多情况下，尸体现象、损伤的判断往往难以准确进行，硅藻作为在大自然界水域中广泛存在的单细胞生物，生前溺死的情况下往往随着溺液进入人体并迅速分散到全身多个器官，并且由于其特
殊结构而不受尸体腐败的影响，即使尸体高度腐败也能检出，因而目前已经成为法医学溺死诊断的重要手段。目前广泛采用的硅藻检验方法为经过酸消化后离心、涂片观察，其过程繁琐、耗时、检材需要量多、易于污染，且试验中用到的试剂如硝酸具有高度腐蚀性因而具有安全隐患［1］，因此，近年藻类学科研究有使用PCR技术进行硅藻检验的报道，为法医学硅藻通过分子生物学技术进行检验带来了曙光［2］。本文在对国内外相关硅藻大量研究文献进行对比后，选择其中被认为对硅藻检验种属性较高COX-Ⅰ区的一对引物KEint2F和KEintR［3］，探讨其应用于法医学溺死硅藻检验的价值。
1 材料与方法
1.1 实验材料
12例水中尸体的肝、肺组织及落水区水样;同时提取非水中尸体肝、肺组织5例。17例标本均来自海南医学院法医鉴定中心检验样本，且按照规范程序提取器官组织和水样，避免水质污染。 1.2 器官组织硅藻检验
各器官组织均分别采用以下两种方法进行硅藻检验。
1.2.1 硅藻硝酸消化镜检法(镜检法) 取送检的肺、肝边缘组织各20 g，放入1 000 mL烧杯里剪碎，加入浓硝酸50 mL，加热消化，过夜。以离心半径10 cm，4 000 r/min，离心15 min，弃上清，加入蒸馏水，再重复前述离心步骤1次，弃上清，将沉淀液滴在载玻片上，烘干、树脂封固镜检。取送检现场水样标本15 mL用上述同样方法离心、镜检，以镜下检出硅藻为阳性。
1.2.2 种属特异性PCR检验法(PCR法) DNA提取:取落水区水样60 mL，12 000 rpm离心10 min，留取管底2 mL待检;肝、肺组织样本各取1 g，剪
碎备检;同时取双蒸水2 mL作为对照。使用Mo-Bio PowerSoilTMDNA Isolation强力土壤DNA提取试剂盒(深圳市安必胜科技有限公司)，按照试剂盒推荐步骤提取DNA，提取的DNA分别通过比色法进行纯度测定、紫外光谱分析法进行定量，并通过2％琼脂糖凝胶电泳分离后用Goldview显色，紫外灯下摄像。
PCR扩增及及产物检测:引物采用Katharine M.Evans等报道的序列，由北京诺
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KEint2F: KEintR:
GAAGCWGGWGTWGGTACWGGWTG; CAAATAAAATTRATWGCWCCTAA。
PCR反应总体积为10 μL，内含0.2 mmol/L dNTPs，3 mmol /L MgCl2，两条引物浓度均为10 μmol /L，0.1 U/μL Taq DNA聚合酶，10×PCR buffer，模板DNA 1 μL。PCR热循环参数: 94℃10 min;94℃30 s，53℃30 s，72℃45 s，共36个循环;最后72℃延伸15 min。
扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳分离后用Goldview显色，紫外灯下以观察到扩增产物为阳性(即样本含硅藻成分)，紫外灯下摄像。 1.3 数据分析
对两种方法对硅藻的检出率进行比较，对其可靠性进行评价。
2 结果
2.1 DNA的提取效果
水样、肺组织、肝组织提取的DNA OD值(260/280)为1.8～2.0，说明该DNA提取方法所获得的DNA纯度较高。三类样本提取的DNA量以水样较少，评价约为42.2 ng/μL左右;肝、肺组织DNA提取量在溺死尸体和非溺死尸体
硅藻COX-Ⅰ区种属特异性PCR用于法医学溺死诊断
