北京诺禾致源生物信息科技有限公司 11.2 差异基因KEGG富集散点图
差异基因KEGG富集分析的散点图，其中四个象限内的KEGG通路的富集程度不同。
图19 差异基因代谢通路分析的四象限图
Rich factor 是差异表达的基因中位于该pathway 条目的基因数目与所有有注释基因中位于该pathway 条目的基因数的比值。Rich factor越大，表
示富集的程度越大。-log10（Qvalue）中Qvalue是做过多重假设检验校正之后的pvalue，-log10（Qvalue）越大，表示富集越显著。
26 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 12．差异基因蛋白互作网络分析
差异基因的蛋白互相作用的信息，结果如图20所示：
图20 差异基因相互作用网络分析
27 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 三、结果说明文档 1. 原始序列数据
FASTQ格式文件中每个read由四行描述，如下： @EAS139:136:FC706VJ:2:2104:15343:197393 1:Y:18:ATCACG
GCTCTTTGCCCTTCTCGTCGAAAATTGTCTCCTCATTCGAAACTTCTCTGT +
@@CFFFDEHHHHFIJJJ@FHGIIIEHIIJBHHHIJJEGIIJJIGHIGHCCF
其中第一行以“@”开头，随后为Illumina 测序标识别符（Sequence Identifiers）和描述文字（选择性部分）。第二行是碱基序列；第三行以“+”开头，随后为Illumina 测序标识别符（选择性部分）；第四行是对应序列的测序质量；(Cock et al.)
Illumina 测序标识别符（Sequence Identifiers）详细信息如下：
EAS139 136 FC706VJ 2 2104 15343 197393 1 Y 18 ATCACG
Unique instrument name
Run ID Flowcell ID Flowcell lane
Tile number within the flowcell lane 'x'-coordinate of the cluster within the tile 'y'-coordinate of the cluster within the tile
Member of a pair, 1 or 2 (paired-end or mate-pair reads only)
Y if the read fails filter (read is bad), N otherwise
0 when none of the control bits are on, otherwise it is an even number
Index sequence
第四行中每个字符对应的ASCII值减去33，即为对应第二行碱基的测序质量值。如果测序错误率用e表示，Illunima HiSeqTM2000/ Miseq的碱基质量值用Qphred表示，则有下列关系：
公式1:
Illunima Casava 1.8版本测序错误率与测序质量值简明对应关系
测序错误率
5% 1% 0.1% 0.01%
测序质量值
13 20 30 40
对应字符
. 5 ? I
碱基识别（Base Calling）分析软件：Illunima Casava 1.8版本 测序参数：双端测序（Paired end）；测序序列读长：100bp （或者单位为循环数(cycle)）
28 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 2. 测序数据质量评估
2.1 测序错误率分布检查
每个碱基测序错误率是通过测序Phred数值（Phred score ,Qphred）通过公式1转化得到，而Phred 数值是在碱基识别(Base Calling)过程通过一种预测碱基判别发生错误概率模型计算得到的，对应关系如下表所显示：
Illunima Casava 1.8版本碱基识别与Phred分值之间的简明对应关系
Phred分值
10 20 30 40
不正确的碱基识别
1 / 10 1 / 100 1 / 1000 1 / 10000
碱基正确识别率
90% 99% 99.9% 99.99%
Q-sorce Q10 Q20 Q30 Q40
对于RNA-seq技术，测序错误率分布具有两个特点：
（1）测序错误率会随着测序序列（Sequenced Reads）的长度的增加而升高，这是由于测序过程中化学试剂的消耗而导致的，并且为illumina高通量测序平台都具有的特征（Erlich and Mitra, 2008; Jiang et al.）。
（2）前6个碱基的位置也会发生较高的测序错误率，而这个长度也正好等于在RNA-seq建库
过程中反转录所需要的随机引物的长度。所以推测这部分较高的测序错误率原因为随机引物和RNA 测序错误率分布检查用于检测在测序长度范围内，有无异常的碱基位置存在高错误率，比如中间位置的碱基的测序错误率显著的高于其他位置。一般情况下，每个碱基位置的测序错误率应该低于0.5 %。
2.2 A/T/G/C含量分布检查
在illumina测序平台的转录组测序中，反转录成cDNA时所用的6bp 的随机引物会引起前几个位置的核苷酸的组成存在一定的偏好性。而这种偏好型独立于所测序的物种和实验室，并会影响转
29 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 录组测序的均一化程度(Hansen et al.)。
除此之外，理论上G和C碱基及A和T碱基含量每个测序循环上应分别相等，且整个测序过程稳定不变，呈水平线。
A/T/G/C含量分布检查用于检测有无AT、GC 分离现象, 而这种现象可能是测序或者建库所带来的，并且会影响后续的定量分析。
2.3 测序数据过滤
数据处理的步骤如下：
1） 去除带接头（adopter）的reads。
2） 去除N（N表示无法确定碱基信息）的比例大于10%的reads。
3） 去除低质量reads（质量值sQ <= 5的碱基数占整个read的50％以上的reads）。
RNA-seq 的接头（Adopter, Oligonucleotide sequences for TruSeqTM Small RNA Sample Prep Kit）信息：
RNA 5’ Adapter (RA5), part # 15013205: 5’ -GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC-3’ RNA 3’ Adapter (RA3), part # 15013207: 5’- TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-3’
原始测序序列（Sequenced Reads）的数据处理（过滤）结果：
不同颜色代表对不同过滤条件的统计
30
转录组有参考生物信息分析结题报告模版-V2.0
