课题3 血红蛋白的提取和分离
蛋白质的各种特性的差异如分子的______和______、所带________________、溶解度、________和对其他分子的亲和力，等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。 一、凝胶色谱法
1．概念：凝胶色谱法也称做__________，是根据____________的大小分离蛋白质的有效方法。 2．原理：大多数凝胶是由________化合物构成的小球体，内部有许多贯穿的通道，当不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量____的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程______，移动速度______；而相对分子质量______的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在________移动，路程______，移动速度______。相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。 3．凝胶材料：______性，______类化合物，如葡聚糖或________。 4．具体过程：
______的蛋白质进入凝胶颗粒内；相对分子质量）洗脱开始，____________（1）________混合物上柱。（2的蛋白质向下移动。的蛋白质被滞留；_____________3）___________的蛋白质则被排阻于凝胶颗粒之外。（中洗脱出来，________的蛋白质行程较短，）___________已从（4）相对分子质量不同的分子完全分开。（5 的蛋白质还在行进中。________________ 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。提示： 二、缓冲溶液 基本不变。____的影响，维持____1．作用：在________内，能够抵制外界的________对溶液使用________溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的______就可以制得在不同2．配制：通常由________ 的缓冲液。 三、电泳 的过程。的作用下发生______1．概念：带电粒子在______下，这些pH________的基团，在一定．原理：许多重要的生物大分子，如______、______等都具有2移动。电泳利________________。在电场的作用下，这些带电分子会向着与所带电荷基团会带上______或，使带电分子产生不同的______________以及分子本身的______、不同，用了分离样品中各种分子__________ 从而实现样品中各种分子的分离。 __________凝胶电泳。3．分类：________凝胶电泳、凝胶电泳。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的在测定蛋白质相对分子质量时通常使用__________________能聚丙烯酰胺凝胶电泳中，SDS等因素。而在SDS—迁移率取决于它所带________的多少以及__________成单条肽链，因此测定的作用下会______________，由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS使
蛋白质发生所带的大量负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，SDS的结果只是________的相对分子质量。同时 。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于__________ 四、蛋白质的提取和分离 。和______________蛋白质的提取和分离一般分为四步：________、粗分离、 ．样品处理及粗分离1是90%__________组成，其中红细胞最多。红细胞的组成中，除水分以外，约血液由__________和。其中每条肽链环绕和两条__________。血红蛋白由________________条肽链组成，包括两条______________________而呈现基团，此基团可携带一分子氧或一分子__________。血红蛋白因含有__________一个 色。 ）红细胞的洗涤（1 。①目的：去除________1，，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色______500 r·min离心2 min离
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心，如②方法：采用________，低速短时间离________，再加入五倍体积的________，缓慢搅拌______将下层______的红细胞液体倒入 ，表明红细胞已洗涤干净。心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有______ 2）血红蛋白的释放（ 页5共 页1第
将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加________到________体积，再加40%体积的______，置于磁力搅拌器上充分搅拌10 min。在________和________的作用下，红细胞______，释放出血红蛋白。
（3）分离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合液离心后可观察到试管中溶液分为4层（从上往下）： 第1层：________的甲苯层。第2层：脂溶性物质的沉淀层——______薄层固体。第3层：________的水溶液——红色透明液体。第4层：其他杂质的________沉淀物。
将液体用______过滤，除去________________，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的________液体。
（4）透析：取1 mL的________溶液装入________中，将其放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol·L1的__________中（pH为______），透析12 h。
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透析袋一般是用硝酸纤维素（又称玻璃纸）制成的，能使______自由进出，而将______保留在袋内。透析可以去除样品中相对分子量较____的杂质，或用于更换样品的______。 2．纯化——凝胶色谱操作
处理后的样品还含有其他种类的蛋白质分子（如呼吸酶等），因此要将杂蛋白与血红蛋白进行分离。
第一步要制作__________。第二步要__________________，因为____的凝胶和用________平衡好的凝胶的体积差别很大，所以装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。在装填凝胶柱时，不能有______存在。第三步是样品的______和______。 3．纯度鉴定——SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
判断________的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。鉴定方法中使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。
答案：形状 大小 电荷的性质和多少 吸附性质 一、1.分配色谱法 相对分子质量
2．多糖类 较小 较长 较慢 较大 凝胶外部 较短 较快 3．多孔 多糖 琼脂糖
4．（1）蛋白质 （2）相对分子质量较小 扩散 较大 （3）相对分子质量较小 相对分子质量较大 （5）相对分子质量较大 层析柱 相对分子质量较小 二、1.一定范围 酸和碱 pH pH 2．1～2种缓冲剂 使用比例 pH范围内 三、1.电场 迁移
2．多肽 核酸 可解离 正电 负电 相反的电极 带电性质不同 大小 形状 迁移速度
3．琼脂糖 聚丙烯酰胺 SDS—聚丙烯酰胺 净电荷 分子的大小 完全变性 解聚 单条肽链 分子的大小
四、样品处理 纯化 纯度鉴定
1．血浆 血细胞 血红蛋白 四 α肽链 β肽链 亚铁血红素 二氧化碳 血红素 红 （1）杂蛋白 低速短时 血浆 暗红色 烧杯 生理盐水 10 min 黄色 （2）蒸馏水 原血液 甲苯 蒸馏水 甲苯 破裂 （3）无色透明 白色 血红蛋白 暗红色 滤纸 脂溶性沉淀层 红色透明 （4）血红蛋白 透析袋 磷酸缓冲液 7.0 小分子 大分子 小 缓冲液
2．凝胶色谱柱 装填凝胶色谱柱 干 缓冲液 气泡 加入 洗脱 3．纯化
1．血红蛋白分离的完整过程
血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，分别是样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除相对分子质量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。
不是所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的，蛋白质的来源和性质不同，分离方法差别很
大。
因为其红细胞 提取血红蛋白的实验材料要选择哺乳动物血液，
中无细胞核，结构简单，血红蛋白含量 的实验材料要选择鸡的红细胞，因为其具有细胞核，含有DNADNA。高。而提取 ．缓冲溶液2发生明显变化的作用叫做缓冲作pH在一定范围内，能对抗少量外来强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液 页5共 页2第
用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。缓冲溶液通常是由一种或两种化合物（缓冲剂）溶解于水中制得的，调节缓冲剂的配比就可制得不同pH范围的缓冲液。缓冲溶液的作用是维持反应体系的pH不变。在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的pH下进行的，受到氢离子浓度的严格调控。为了在实验室条件下准确地模拟生物体内的天然环境，就必须保持体外生物化学
反应过程有与体内过程完全相同的pH。
实验中缓冲液用量要远多于血红蛋白溶液量，有利于杂质分子充分地向外扩散。 —聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量．用SDS3聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量时，可选用一组已知相对分子质量的标准SDS—使用蛋白同时进行电泳，根据已知相对分子质量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和相对分子质量的 对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的相对分子质量。）样品3—聚丙烯酰胺凝胶制备；（1）根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板；（2）SDS（具体步骤如下：，样品可以多加几25 μL）加样：按顺序加样，加样量通常为10～处理；（4）把凝胶固定于电泳装置上；（5 ）观察结果。（10）染色；（8（9）脱色；个；
（6）电泳；（7）剥胶；
SDS的结合程度。SDS电泳的成功关键
人教版生物高二选修一53血红蛋白的提取和分离学案有答案 副本
