放射性标记技术在药物研发中的作用

放射性标记技术在药物研发中的作用

文章来源于本人微信公众号DMPK

全面地研究所有药物相关物质在体内的变化规律，对于药物安全性和有效性的评估至关重要。LC/MS技术常用于定量分析体内外试验中母药的PK特征，代谢物通常结合预期的代谢物结构预测进行分析。该方法存在一定的限制性，代谢物和母药的质谱响应水平的差别可能造成相对定量的偏差；化学合成手段无法合成体内某些代谢物的标准品；无法反应多级代谢过程；漏掉与组织结合的相关物质等。此时，放射性标记技术显得十分必要，代谢物的定量变得简单直接，直接采用代谢物和母药的比活度表示，同时可以找到与组织蛋白共价结合的母药或代谢物。下文将就放射性标记技术在药物DMPK研究中的方法和应用进行阐述。

1 放射性标签的选择

由于化合物分子中均含有C和H，常用的标签主要为3H和14C两种。这两种放射性标签的半衰期相对于试验周期均较长，无需校正放射性天然衰减过程。氚标优势：合成相对简单快捷；可合成高比活性的标记化合物用于低剂量高活性化合物的研究。氚标劣势：生物不稳定性；同位素效应影响化合物代谢特征；氧化代谢生成氘化水造成放射性标记丢失。因此，除非14C标记化合物的合成难度极大，开发阶段大部分ADME研究用14C标记，氚标一般只限用于研究蛋白或受体结合性研究，或早期临床前的探索性研究用氚标后再用14C验证。通常14C标记化合物的合成难度高于3H。14C通常需要根据初期

的代谢数据，选择化合物化合物分子结构的核心位置，防止代谢物放射性标签的丢失。

2 放射性标记技术在DMPK研究中的应用2.1 共价蛋白结合/反应性代谢

物

药物的大多数代谢过程均产生水溶性代谢物，类似解毒过程。然而少部分药物可代谢生成反应性代谢物，其可能与功能酶、DNA等大分子共价结合（CPB），造成酶失活或严重的毒副作用，应尽量在药物发现阶段避免选择该类分子。药物与蛋白发生共价结合后，常规方法无法检测，放射性标记法可解决该问题。将带标记的化合物在体外与肝微粒体或肝细胞孵育后，与蛋白共价结合的药物浓度超过50pmol/mg protein时即认为发生了共价结合，该阈值可依据具体筛选需求进行调整。CPB的发生并不能在机制上证明反应性代谢物的产生，将试验体系中引入谷胱甘肽、氰化物等成分捕获代谢物，若CPB在捕获作用下显著降低，表明了反应性代谢物的产生，再对该类代谢物进行鉴定后对化合物的结构优化具有重要的意义。体内的物料平衡试验（mass balance）中亦可提示药物或代谢物与蛋白发生共价结合的可能。当血浆放射性的半衰期显著长于药物自身半衰期时，且回收率低于80%时，则有可能发生了代谢物与血浆蛋白的共价结合。该类方法同样可以用于共价抑制剂药物的研究。 2.2 定量全身放射自显影（QWBA）

QWBA可用于研究化合物全身分布和各组织放射性标记药物的消除规律。其最大优势是无需进行任何代谢物鉴定，即可研究所有组织中药物相关物质的分布和消除规律，尤其是靶点组织和潜在毒性组织。QWBA可以亦可用于拓宽常规可研究组织的范围，比如皮肤、眼部、髓鞘、胎儿等。此外，组织切片

在溶剂清洗作用下大部分化合物会脱落，而共价结合的化合物会保留亦可用于辅助化合物安全性评估。临床前动物QWBA研究除了发现化合物潜在的蓄积风险，亦可根据组织消除速率辅助人体放射性试验中剂量的设置。 2.3 Mass balance研究

物料平衡试验的目的为了揭示化合物吸收进入系统循环的量，着重于找到化合物母药和代谢物的排泄速率和途径。该试验为药物开发的常规研究，对于使用氚标或14C无明确的要求。一般更倾向于使用14C。给药方式应采用拟开发的给药方式，一般于给药后0，6，12，24，48h等时间点收集尿液，粪便样品一般每24h收集一次，具体截止试验需更具化合物的消除规律制定，满足回收率和定量要求即可，一般认为回收率大于95%，或24小时间隔内的回收量小于1%。当发生较低的放射性回收率或较慢的消除速率时，则需要对母药或代谢物共价结合作用进行进一步研究。临床前的放射性物料平衡研究的种属，应该参考代谢物研究结果、毒理研究种属进行选择。该放射性研究一般在早期少数个体中进行，若发现活性或反应性代谢物，可适当将该研究后置。Mass balance的样品可利用放射性标记的优势用于进行代谢物鉴定，定量分析每种代谢物经各个途径的排泄情况。 2.4 代谢物安全性评价（MIST）

临床前安全性试验评价的基础是毒理种属的化合物种类和绝对量足够覆盖其在人体中的水平，详细可参考《代谢物安全性评价(Metabolites in Safety Testing，MIST)》。其中母药和代谢物的暴露水平则十分重要，一般采用LC/MS对临床前毒理和临床样品进行代谢物的定量分析，虽然该方法较方便，但离子化效率的差异可能对结果造成较大的偏差，造成代谢物水平的低估或高估。而