33.1 专属性/选择性ICH把专属性定义为“当预料到一些组分可能存在时，准确无误地检测被分析物的能力。通常这些可能存在的组分有杂质、降解产物、基质等。”USP<1225>中对此有相同的定义，但同时说明其他著名组织如IUPAC和AOAD等使用“选择性”表明相同的含义。这里留着“专属性”用来表示每一种被分析物只产生一个响应的过程。ISO/IEC很可能也有相同的理解，因为它要求方法具有“选择性”而非专属性。我们的目的是从所有的其他化合物中区分出目标化合物的响应并加以定量分析。那些能够在所有可能存在的样品组分中检测被分析物响应值的分析技术，应进行专属性验证。有时无法证明某个分析过程专属于某种特定的被分析物。在这种情况下，建议采用两种或两种以上的分析方法组合以达到必要的鉴别水平。在药品实验室经常使用的一种技术是高效液相色谱法（HPLC），有些情况下也用气相色谱法（GC）。实际操作时，制备一个包含有被分析物和所有可能存在组分的混合样品，将结果与被分析物的响应值相比较。在药品混合样品中，可能有来自合成中间体、赋形剂和降解产物的组分。把样品置于苛刻的条件下（如高温、高湿或光照等），可以加速降解产物的生成。通过选择合适的色谱柱和设置色谱条件可以获得液相色谱的专属性，如调整流动相组成、柱温和检测器波长等。除了色谱分离过程外，样品制备步骤也可以优化以达到最优的选择性。在色谱中，确认样品色谱图中的色谱峰纯度是一件困难的事，色谱峰可能存在不止一个化合物。分析工作者应该知道样品中存在多少化合物，而这通常是不可能的。因此，应评价目标化合物色谱峰的纯度。153过去的做法是改变流动相组成或色谱柱等色谱参数，而现在是使用与色谱同步的在线光谱检测器。紫外-可见二极管阵列检测器和质谱仪在整个色谱图运行期间均能在线采集光谱数据。比较和洗脱的色谱峰相对应的光谱图，如果光谱图不同，说明该色谱峰中至少包含两个化合物。使用光谱检测器进行专属性评价的原理见图3，以高效液相色谱法（HPLC）和紫外-可见二极管阵列检测器为例。图中显示了一个专属性色谱方法和一个非专属性色谱方法。两个色谱峰看起来非常相似。从峰形来看，无法明显看出该色谱峰中包含一个或几个化合物。这两个例子中，分别在色谱峰的上行和下行处查看其UV光谱图，归一化后进行比较。左例中，光谱图是相同的，表明该色谱峰中只有一个化合物，或者说该色谱峰是光谱纯的。右例中，两个UV光谱图不同，由此证明该色谱峰显然不纯。先进的二极管阵列检测器能够对光谱图进行自动比较，并打印出每个色谱峰的匹配因子。这样，结合图形可视化技术，就可以在不增加工作负担的同时进行选择性评估。UV ????????????UV ?????????????????????????????图3. 色谱峰的不同位置有相同的光谱图，证明该色谱峰是纯的（左）光谱图不同，证明该色谱峰不纯（右）163当共洗脱化合物的光谱图非常接近时，紫外-可见二极管阵列检测器就有其局限性，这在代谢物及其母体化合物时极有可能发生。这种情况下，最好为HPLC配一个质谱检测器。质谱通常比紫外光谱专属性更强，因此常用于色谱的选择性评价。一个HPLC与质谱配合使用的例子见图4。对于4.86分钟洗脱的色谱峰，在不同部位采集的质谱图不同，显示该色谱峰不纯。选择性研究还应评估基质可能带来的干扰，如尿、血、土壤、水或食品等。好的样品制备可以消除大部分基质成分。对于一个定量方法，应分析至少5种不同来源的控制基质以证明其不受基质干扰。207.1207.1208.1216.0230.1235.0237.0255.14.8615.3925.1245.6225.8265.993100806040200100806040200150200250300350min.229.1252.2208.1????????158.9150200250300350400????2250003.2343.3283.5813.767175000125000750002500012342.2064.3244.4754.6847.2127????56图4. 4.86分钟时色谱峰不同部位采集的质谱图显示该色谱峰不纯1733.2 精密度ICH把分析方法的精密度定义为在规定条件下，对均匀的样品多次取样并进行一系列测量，其结果的一致性（离散程度）。精密度可以在以下三个层面考虑：重复性、中间精密度和重现性。重复性是通过在很短的时间间隔里和相同的操作条件下得到的结果来表达精密度。重复性也称作同一次分析的组内精密度中间精密度通过实验室内不同日期、不同分析人员、不同设备等所得结果来表达精密度重现性表示不同实验室间的精密度（协作研究时通常用其进行方法标准化）ICH5在进行重复性计算时，要求待测组分浓度在100%时重复测量至少6次，或覆盖整个规定浓度范围并重复测量至少9次。例如，可以在三个不同浓度分别进样三次。中间精密度通过比较同一实验室数日内各次检测的结果计算而得。方法的中间精密度可以反映以下因素引起的结果差异：不同的操作人员不一致的操作实际不同的仪器不同供应商的标准品和试剂不同批次的色谱柱综合因素中间精密度验证的目的是证实当方法开发阶段结果后，在同一个实验室内运用该方法能够得到相同的结果。183重现性的目的是证实方法在不同实验室运行能够能到相同的结果。分析方法的重现性通过不同实验室的不同分析人员对均匀样品各部分分析的结果计算而得。另外，通常操作人员和环境条件产生的偏离可能不同，但仍在所用方法的规定参数范围内。重现性的验证对于在不同实验室使用的方法非常重要。可能影响重现性的因素有房间温湿度的差异，或设备的特征参数不同（如HPLC系统的延迟时间不同），色谱柱的厂家或批号不同，以及操作人员的经验和想法不同。3.3 准确度和回收率ICH把分析方法的准确度定义为测定值与传统真值或接受的参考值之间接近或一致的程度。准确度也可以定义为方法的测定值与真值接近的程度。用作准确度评价的真值可以通过几种方式获得。一种做法是把方法结果与已建立的参考方法比较。这种办法认为参考方法的不确定度是已知的。第二种准确度评价办法是分析已知浓度的样品（例如，控制样或有证标准物质），把测得值与该物质提供的真值相比较。如果无法得到有证标准物质或控制样，可以在空白的样品基质中加入已知质量或体积浓度的被分析物。从基质中提取出被分析物，注入分析仪器后，比较提取物的响应值与溶解在纯溶剂中的参考物质的响应值。由于准确度评价能够检查样品制备的有效性，在制备模拟样品时应尽可能与实际样品的制备过程相一致。如果经过准确验证，可以用不同浓度所得的回收率对最终结果进行校正。19
分析方法验证 - 图文
