玉米耐低温种质资源的鉴定和筛选
李红飞 郭薇 覃光恒 李一 王建华
（中国农业大学农学与生物技术学院/种子科学中心，北京 100193）
摘要：本试验对654份玉米自交系的耐低温特性进行了鉴定，在常温（25℃）和低温（10℃）胁迫下分别测定种子的发芽率以及低温胁迫下的发芽时间。以相对发芽率和平均发芽时间作为耐低温特性评价指标，通过聚类分析筛选到30份强耐低温自交系和43份对低温胁迫强敏感自交系，为培育耐低温玉米新品种和挖掘耐低温相关基因提供种质资源。 关键词：玉米；耐低温；相对发芽率；平均发芽时间；聚类分析
Abstract: The chilling tolerance of 654 maize inbred lines were investigated by determining germination rate at normal temperature(25℃) and germination rate and germination time on cold stress (10℃)．The relative germination rate and the mean germination time were used to assess the chilling tolerance. By cluster analysis of the screening to 30 strong chilling tolerance maize inbred lines and 43 strong sensitive maize inbred lines on cold stress, to cultivate resistance to chilling corn varieties and mining related genes provide germplasm resources.
Key words：maize；chilling tolerance；relative germination rate；the mean germination time ；cluster analysis
2012年我国的玉米播种面积达到34949千公顷，产量达20812万吨，玉米超越稻谷成为我国第一大粮食作物。东北华北春玉米生产区是我国重要的玉米主产区之一，但是由于这些区域春季气候寒冷，积温低，玉米春播面临低温高湿的严重危害，玉米种子常常出现烂粒不出苗、苗弱、出苗不齐等问题。目前生产中可适应该区域积温要求的玉米品种仅有德国KWS公司的德美亚1号、2号、3号等少数品种，远远不能满足生产实际需要，培育耐低温早熟玉米新品种成为我国春玉米区的紧迫需求。本试验通过研究不同玉米自交系耐低温能力的差异，鉴定和筛选耐低温的玉米材料，为培育耐低温玉米新品种和挖掘耐低温相关基因提供种质资源和奠定基础。
1 材料与方法
1.1试验材料
654份不同的玉米自交系。材料由中国农业科学院作物科学研究所提供。
1.2试验方法
标准发芽试验（纸床发芽法）：
从净种子中选取25粒相对大小一致的种子，将玉米种子用1%的次氯酸钠溶液浸泡5 min，用去离子水重复清洗至无味即可。用数种板将种子均匀地分布在湿润的发芽床上（发芽纸经过121℃高温灭菌30min，然后用去离子水充分浸泡12h），卷起后竖直地放在12号自封袋中，三次重复，将其放置在25℃发芽室里，第7d统计不同自交系的发芽率。 低温发芽试验（砂床发芽法）：
将已灭菌的砂加去离子水拌匀，使砂的含水量为16%。将湿砂放于发芽盒（60×42.5×16.5cm）内摊平，厚度为5cm，贴标签，然后播入经过1%的次氯酸钠溶液消毒的种子30粒，再盖上3cm湿砂，盖好黑色塑料袋，防止水分散失，每个发芽盒内可播15个材料，3次重复。不同玉米材料在10℃低温黑暗条件下萌发，从第15天开始每天记录发芽种子数，第35天统计发芽率，计算发芽平均时间。
李红飞，硕士研究生，研究方向：不同种质资源玉米种子活力的全基因组关联分析，
邮箱：hongfeili2011@163.com
相对发芽率=低温条件下发芽率/标准发芽率×100%
平均发芽时间MGT=ΣDn/Σn,其中n为第D天新萌发的种子数，D为从发芽试验开始计算的天数[1]。
2 结果与分析
2.1标准发芽试验
不同玉米自交系在25℃条件下第7d的发芽率分布如图一。不同玉米自交系材料在25℃环境下的发芽率存在差异，发芽率处于80%-90%区间的材料最多，达到174个。81.8%的自交系材料的标准发芽率在60%以上，44.6%的自交系材料的标准发芽率在80%以上。其中发芽率最高的为80号材料，发芽率达到100%；发芽率最低的为446号材料，发芽率为13.3%。
2.2低温发芽试验
不同玉米自交系材料在10℃低温冷害条件下的发芽率分布如图二。不同材料在10℃低温条件下的发芽率存在显著差异，发芽率以处于0-10%区间的材料最多，达到了227个，占总数的34.7%。17.3%的材料的低温发芽率在60%以上，只有3.2%的材料的低温发芽率达80%以上。其中5号、8号等共27个材料的低温发芽率为0，最高的为82号材料达到95.6%
2.3相对发芽率
以相对发芽率（低温发芽率与标准发芽试验发芽率的比值）作为衡量玉米自交系耐低温能力的指标之一，不同玉米自交系材料的相对发芽率分布如图三，相对发芽率处于0-10%区间的材料最多，达到200份，占总数的30.6%；相对发芽率在80%以上的材料为83份，占总数的12.7%。其中617号的相对发芽率最高，为99.7%（低温发芽率为87.8%，标准发芽率为88%）；由于5号、8号等共27个材料的10℃低温冷害条件下发芽率为0故这些材料相对发芽率为0。
2.4 10℃低温条件下的平均发芽时间
玉米种子在低温胁迫下的发芽时间延长，不同材料（除去其中27个低温发芽率为0的材料）在10℃低温条件下的平均发芽时间分布如图4，平均发芽时间25-30d的材料达到335个，占总数的51.2%，其中平均发芽时间最短的为18.2d（其低温条件下的发芽率为73.3%），278号等材料的平均发芽时间达35d（其低温条件下的发芽率为1.1%）。
2.5 聚类分析
经过标准发芽试验和低温发芽试验，以相对发芽率和平均发芽时间作为衡量玉米自交系耐低温能力的指标，以相对发芽率和平均发芽时间为变量进行聚类分析，共分为3类：耐低温材料、较耐低温材料、低温胁迫敏感材料。聚类分析的结果是82号、652号等161份自交系为耐低温材料，13号、106号等174份材料为较耐低温材料，262号、329号等319份材料为低温胁迫敏感材料。再次对161份耐低温种质进行聚类，得到强耐低温种质30份。这30份强耐低温玉米自交系的标准发芽率位于86.7%-100%之间，相对发芽率位于81.0%-99.7%之间，如82号材料的标准发芽率为97.3%，在10℃低温胁迫条件下的低温发芽率为95.6%，相对发芽率达到98.2%。同样对319份低温胁迫敏感材料再次进行聚类分析得到对低温胁迫强敏感材料43份。这43份强敏感玉米自交系的标准发芽率在88%-98.7%之间，而绝大多数材料低温发芽率在5%以下，如636号材料的标准发芽率为97.3%而低温发芽率只有1.1%。这30份强耐低温材料和43份强敏感材料为培育耐低温玉米新品种和挖掘耐低温相关基因提供种质资源和奠定基础。
3 结论
本试验对654份玉米自交系的耐低温特进行了鉴定，进行25℃条件下的标准发芽试验和10℃低温胁迫下的低温发芽试验，测定了种子的发芽率以及不同材料低温胁迫下的发芽时间。以不同玉米材料的相对发芽率和平均发芽时间作为耐低温特性评价指标，通过聚类分析共鉴定了耐低温材料161份，较耐低温材料174份，对低温胁迫敏感材料319份。对耐低温材料和低温敏感材料进一步筛选，共得到30份强耐低温玉米自交系材料（如P9-10、220）和43份对低温胁迫强敏感玉米自交系材料（如Liao5263、Y1846、Y1518、P136C等），利用其构建耐低温遗传群体，为耐低温相关性状的定位提供材料和奠定基础。因此相对发芽率和平均发芽时间可以作为鉴定和筛选耐低温玉米种质的性状指标。
4 讨论
4.1耐低温种质资源鉴定的方法
耐低温种质资源的鉴定主要包括田间鉴定法和室内鉴定法。田间鉴定直接利用自然低温
环境，一般以调整播期来创造低温胁迫环境[2]，通过对耐低温相关性状指标的观测来鉴定耐低温种质资源。此鉴定方法接近大田实际情况，但是由于田间温度的不可预知性和波动性造成试验结果不够准确、重复性较差。室内鉴定是在实验室人工控制条件下利用玉米种子低温发芽来鉴定材料的耐低温特性，不仅简便、可靠，而且周期性短，适合对大量的材料进行初级鉴定和筛选。V. M. Rodríguez等[2]利用室内鉴定和田间方法对欧洲玉米种质资源的耐低温特性进行了评估。他们将经过筛选后的11个欧盟玉米地方品种、3个改良群体以及5个耐冷杂交种通过室内鉴定并结合田间表现发现Aranga1是改良耐冷适应性最合适的候选材料。本试验共654份材料，由于材料较多，宜采取室内鉴定的方法。首先通过室内鉴定共筛选了30份强耐低温材料，接下来可以通过大田观察来进一步进行验证。
4.2玉米种质资源耐冷性鉴定的性状指标选择
目前对耐低温性研究主要集中在萌发期和幼苗期，因为玉米在这两个时期对冷害胁迫比较敏感，因此耐低温特性鉴定的性状指标主要集中在萌发期和幼苗期的性状指标，包括生长发育与形态指标和生理生化指标上。
4.2.1生长发育与形态指标
在低温冷害胁迫下耐低温特性弱的玉米材料在种子萌发、幼苗生长均受到严重的抑制，种子的发芽率、发芽势、发芽指数均降低，发芽时间延长 [3] ，因此发芽率、发芽势、发芽指数、发芽时间、出苗率、出苗指数、幼苗活力等都是常用的生长发育与形态指标。扈光辉[4]
利用60份玉米自交系设置20、11、7℃3种温度处理逐级进行鉴定，以不同温度处理下的平均发芽率和平均出苗指数为鉴定指标共筛选出耐低温材料5份：2001-F32、FR1454、HR295、LINE KIN060和KN3。V. M. Rodríguez等[2]测定和考察了6个与耐低温特性相关的性状：叶色、幼苗活力、发芽率、发芽时间、出苗评级和最后存活率，研究发现Aranga1是改良耐冷适应性最合适的候选材料。郑昀晔等[5]通过对9个玉米自交系在发芽期和苗期的耐低温特性鉴定发现相对发芽率、相对幼苗总干重、相对地上部苗干重、相对根干重之间显著相关，是较好的耐低温特性评价指标。
4.2.2生理生化指标
低温冷害胁迫会破坏原生质膜的稳定性，使原生质膜的透性增加，导致电解质渗透率增加，因此电解质渗透率常作为玉米耐低温种质资源的鉴定指标。Ho-Min Kang等[6]利用电解质渗透率作为指标进行了玉米的耐冷性研究。在低温冷害胁迫下玉米幼苗的叶绿素含量降低，耐低温特性强的材料叶绿素下降的少，耐低温特性弱的材料下降的快，因此叶绿素含量指标可以对玉米材料的耐低温特性进行鉴定。Suzan E. Hetherington等[7]将不同作物在7℃低温下胁迫20h测定叶绿素含量，发现幼苗叶绿素含量可以作为玉米耐低温鉴定的指标之一。此外游离脯氨酸含量、POD、SOD、CAT、MDHAR和ASPX活性、丙二醛等均可作为玉米种质资源鉴定中的指标[8-9]。
在玉米耐低温种质资源的鉴定中往往采取生长发育与形态指标和生理生化指标相结合进行综合评价。贺正华等[10]对66份甜玉米和25份糯玉米自交系进行鉴定，3叶1心时进行3℃的低温胁迫处理，1d后测定相对电导率，7d后观察叶片萎焉程度，筛选出了耐冷性强的甜玉米材料8份和糯玉米材料6份。郭发华等[11]将Suwan-3、阳单82、墨2174、墨3130、越P47和越LVN12等6个玉米品种温度为25±2℃条件下培养7d，然后进行温度为1℃的冷胁迫处理3d。测定叶片的相对电解质渗出率、叶绿素含量和幼苗存活率，结果显示：墨2174和墨3130的幼苗存活率高、电解质泄露和叶绿素含量变化少，表明这两个品种的耐低温特性强；Suwan-3、阳单82、越P47和越LVN12四个品种幼苗存活率低、电解质泄露显著增加、叶绿素含量下降，表明这四个品种对低温胁迫较敏感。
由于电解质渗透率、叶绿素含量等生理生化指标的测定对测定的环境和采样要求非常严
玉米耐低温种质资源的鉴定和筛选
