环境水样品中大肠杆菌及粪（耐热）大肠杆菌的检测
【摘要】本次实验采用多管发酵法检测环境水样中大肠杆菌及粪大肠杆菌（环境水样取用
水果湖样点水样）。本次试验（多管发酵法）的主要步骤为：将待测水样稀释三个（实际上做了四个）适宜稀释倍数梯度，接种在乳糖蛋白胨培养液中，产酸产气为阳性结果，
37℃下培养24h，观测结果。
EC肉汤培养液中，
不产酸产气为阴性。将阳性管中菌液取定量接种于
于对应温度下培养
45℃下培养24h，观测结果。产酸并产气为阳性结果，不产酸不产气为阴性。将阳性管中菌及之前37℃管中菌接种于伊红美蓝培养基上，
24h，镜检。根据菌落形态MPN检索可查水样中总大肠
和颜色，可确认大肠杆菌阳性结果。根据大肠杆菌阳性管数的(GB3838-2002)对比，判定水质。
杆菌和耐热大肠杆菌的最大或然数。再与《中华人民共和国地表水环境质量标准》
【关键词】环境水样大肠杆菌耐热大肠杆菌
气
多管发酵法最大或然数（MPN）产酸产
【前言】水体的污染程度可大致由总大肠杆菌数及耐热大肠杆菌数反映出来。大肠杆菌为
革兰氏阴性菌，无芽胞，糖代谢时可产酸产气，可使溴甲酚紫由紫色变为黄色，并可通过伊红美蓝培养基鉴定，大肠杆菌发酵乳糖造成的酸性环境，产生带核心的，有金属光泽的深紫色菌落。见于人类或动物的粪便中，可耐高温，当由
使两种染料结合成复合物，
使菌群由于它多
耐热大肠杆菌是一种特殊的大肠杆菌，
37℃环境变为45℃时，依旧可以正常生长。当
水体被粪便污染时，其含量较高，由此判断水质高低。：【材料与方法】（一）材料
乳糖蛋白胨培养液：蛋白胨EC肉汤培养基：胰蛋白胨伊红美蓝培养基：蛋白胨4.5 mL无菌水：4支（二）器材
无菌1 mL移液管：4支；40~200 微升移液器、吸气器：各200微升无菌Tip：20只；载玻片和盖玻片若干；革兰氏染色各试剂；培养皿若干套；酒精灯；显微镜等（二）原理及方法
1、样品的稀释和培养：
取原环境水样
0.5ml加入到4.5ml无菌水中，混合均匀，制成
10
-1
10g、牛肉膏3g、乳糖5g、氯化钠5g、1.6%溴甲酚紫乙醇
（10ml/试管+小倒管20支）
4g 、磷酸二氢钾
（10ml/试管+小倒管10支）2g、琼脂20~30g、2%伊红水溶
20g、3号胆盐1.5g、乳糖5g、磷酸氢二钾10g、乳糖10g、磷酸氢二钾
溶液1ml、蒸馏水1000ml
1.5g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml
液20ml、0.5%美蓝水溶液13ml、蒸馏水1000ml （150ml/瓶）
1支；
样品；再从
10样品中溶液取10样品中溶液取10样品中溶液取个稀释度样品各
-3-2
-1
0.5ml加入到4.5ml无菌水中，混合均匀，制成0.5ml加入到4.5ml无菌水中，混合均匀，制成0.5ml加入到4.5ml无菌水中，混合均匀，制成
-1
-2
-3
-4
10样品；再从10样品，再从10样品，每个
-4-3
-2
稀释度两管。再从10、10、10和10样品中各取1ml到乳糖蛋白胨培养基中（每
5支试管）
2、初发酵实验：
原理：发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置杜氏小套管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，
而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。
为便于
观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为
PH指示剂，细菌产酸后，培养
基即由原来的紫色变为黄色。溴甲还有抑制其他细菌如芽孢杆菌的生长的作用。
方法：（1）将上述15支试管放入37℃中培养24h；
（2）取出试管观察，若发现试管由紫色变成了黄色，即证明产酸；若发
现小倒管中有气泡产生，即证明产气；
（3）记录各试管的产酸产气的情况，将阳性反应（产酸产气）的试管中
的样品取一滴（50μ）L转接于EC培养基上，并做好标记。
注：在量少的情况下，也可能延迟
48h后才产酸产气，此时应视为可疑结果。
48h培养后仍不产酸产气的为阴性反应。
3、45℃培养鉴定：
原理：37℃下培养产生阳性反应的试管样品不一定是全部都是粪大肠杆菌，经过45℃下培养，若还能产生阳性反应的即可能为粪大肠杆菌（耐热性较好）
方法：（1）将上一步接种的
EC培养基的试管置于
45℃下培养24h；
（2）取出试管观察，记录发生阳性反应的试管（产酸并产气）
4、平板分离：
原理：伊红美蓝琼脂平板含有伊红和美蓝染料，在此亦作为指示剂，大肠菌群
发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料即结合成复合物，有金属光泽的深紫色（龙胆紫的紫色）阳性菌落。
方法：（1）将37℃培养管（48h）和45℃培养中的发生阳性反应的试管中的菌
接种于伊红美蓝培养平板，分别再于
37℃和45℃的条件下培养过夜。
（2）培养过夜后取出平板，挑选深紫色、具金属光泽，紫黑色、不带或略带金属光泽，淡紫红色中心颜色较深的菌落。
5
、革兰氏染色：
原理：大肠杆菌为革兰氏染色阴性菌，经过革兰氏染色后在显微镜下显示为红色杆状（有的能观察到芽胞）。
方法：挑选伊红美蓝培养阳性的菌落，进行革兰氏染色，镜检为红色且无芽胞即为大肠杆菌群。
6、查阅MPN表，得出全部大肠杆菌和耐热大肠杆菌的最可能数。
使大肠菌群产生带核心的、
【结果与讨论】
1.
实验结果记录1.1
37℃培养24小时后，10、10和10均产酸产气，为阳性结果；
-1
-2
-3
10中只有
-4
C管产酸产气，其余四管不产酸不产气。
现象试管号
产酸产气
A B
10-1
C D E A B
10-2
C D E A B
10
-3
+ + + + + + + + + + + + + + +
——
+ + + + + + + + + + + + + + +
——
C D E A B
10
-4
C D E
+
——
+
——
“+”为有此现象，“—”为无此现象。
-1
37℃10稀释度
37℃ 10
-2
稀释度
37℃10稀释度
-3
37℃10-4稀释度
1.2
阳性管中样品接种于
EC培养基（16管），45℃培养24小时后，10、10
-1
-2
环境水样品中大肠杆菌及粪（耐热）大肠杆菌的检测复习课程 - 图文
