项目名称：项目编号：编制单位：
编制说明
绵羊和山羊源性成分同步检测方法 实时荧光PCR法内质监标函〔2024〕307号 锡林郭勒职业学院
一、工作简况
本项目来源于2024年第3批内蒙古自治区地方标准制修订项目（内质监标函〔2024〕307号）。起草单位为锡林郭勒职业学院，协作单位为锡林郭勒食品检验检测和风险评估中心。主要起草人：郭梁、刘国强、于园、徐伟良、罗建兴、李春冬。
二、制定标准的必要性和意义
来源于绵羊和山羊的肉制品深受消费者的喜爱，是农畜产品市场中重要组成部分。市场中存在用低价肉冒充绵羊和山羊肉等高价肉的欺诈违法行为，亟需制定针对肉乳制品的绵羊和山羊源性成分同步检测方法。目前，已经存在六项羊源性检测方法标准：饲料中牛羊源性成分的定性检测 定性聚合酶链式反应（PCR）法（GB/T 20240-2006）；明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法 实时荧光PCR法（GB/T 25165-2010）；动物源性饲料中反刍动物源性成分(牛,羊,鹿)定性检测方法 PCR方法（GB/T 21104-2007）；饲料中牛羊源性成分检测 实时荧光聚合酶链反应法（NY/T 1946-2010）；食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法 实时PCR法（SN/T 2051-2008）；动物产品中牛、山羊和绵羊源性成分三重实时荧光PCR检测方法（SN/T 2980-2011）。在采用上述检测标准后发现：目前缺乏基于多重实时荧光PCR法、同管质量控制体系、针对肉乳制品的绵羊和山羊源性成分同步检测方法的相关标准。本标准是基于多重实时荧光PCR法、同管质量控制体系、针对肉乳制品的绵羊和山羊源性成分同步检测方法的相关
标准，具有快速、高通量以及去除假阴性等特征。
三、主要起草过程
本标准制定工作从2024年10月开始，组织成立了标准起草团队。起草团队首先进行相关标准、专利以及论文的收集和整理工作，制定了基于多重实时荧光PCR法、同管质量控制体系、针对肉乳制品的动物源性成分检测标准体系的研发目标，计划形成绵羊（Ovis aries）、山羊（Capra hircus）、马（Equus caballus）、黄牛（Bos taurus）、水牛（Bubalus bubalis）、牦牛（Bos grunniens）、猪（Sus scrofa）、驴（Equus asinus）、双峰驼（Camelus bactrianus）、梅花鹿（Cervus nippon）、鸡（Gallus gallus）、鸭（Anas
platyrhynchos）及鹅（Anser anser）等13个物种、针对肉（鲜肉、肉干及香肠）和乳（鲜乳、发酵乳、乳酪及乳粉）的常见动物源性成分检测标准体系。
具体实验过程如下：
（一） 在NCBI中下载不同物种（绵羊、山羊、马、牛、水牛、牦牛、猪、驴、双峰驼、梅花鹿、鸡、鸭及鹅等13个物种）的线粒体序列。为了保证引物和探针的物种适用性，每个物种下载5-20个品种或品系的线粒体序列；利用生物信息学软件（Clustal X或MAGE 5）对所下载的线粒体序列进行比对。筛选物种间特异品种间保守的序列为目标靶向区域（5-10个），针对目标靶向
区域设计5组引物和探针组合。上游引物的3’端距离探针的5’端为1-20 bp，探针的5’端避免出现G，探针Tm要高于引物Tm值10℃左右；不同物种的探针用不同的荧光基团标记（FAM、HEX、ROX以及CY5）；如果探针Tm值和引物Tm值接近，探针3’端可以选择MGB基团；
（二） 收集各种来源于不同动物的肉（鲜肉、肉干及香肠）。利用改良CTAB法提取样品的DNA（A260 nm/A280 nm≈1.8，琼脂糖凝胶电泳主带无拖尾，Nanodrop和Qubit定量一致性较高）； （三） 特异性分析：利用实时荧光PCR对5组引物和探针进行检测，有典型扩增曲线且Ct值≤35计为检出。在阳性对照检出、阴性对照未检出、对5组引物和探针进行特异性的分析评价。反应体系（20 μL）：TransStart Probe qPCR SuperMix 10 μL（北京全式金生物技术有限公司），引物各1 μL，探针各0.5 μL，模板DNA 1 μL，补水至20 μL。反应条件：94℃、30 s，1个循环；94℃、5 s，60℃、31 s，40个循环；
（四） 绝对灵敏度分析：以来源于不同肉乳制品的高质量DNA为模板母液，用灭菌ddH2O稀释模板母液，共稀释10个梯度，稀释后质量浓度分别为100、10、1、0.1、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00001 ng/μL。以不同稀释浓度的DNA为模板对5组引物和探针进行检测，根据PCR反应的Ct值分析此方法对于不同浓度模板DNA的检测灵敏度。检出限（LOD）统计分析参照Probit analysis。比较5组引物和探针的绝对灵敏度，分析
引物和探针的特异性和保守性与绝对灵敏度之间的相关性； （五） 掺假检出限（相对灵敏度）分析：首先，制备模拟掺假混合样品（0.1%、1%、10%、30%、70%、90%、99%、99.9%），以上述掺假组为模板对5组引物和探针进行检测，根据PCR反应的Ct值分析此方法对于不同浓度掺假的掺假检出限。检出限（LOD）统计分析参照Probit analysis。比较5组引物和探针的掺假检出限（相对灵敏度），分析引物和探针的特异性和保守性与掺假检出限之间的相关性；
（六） 定量分析：以模板质量浓度和掺假浓度的对数为横坐标，以Ct值为纵坐标，构建绝对定量标准曲线和掺假定量标准曲线，分析引物和探针的特异性和保守性与扩增效率和相关系数的相关性；利用已知浓度的盲样验证定量标准曲线的适用性，通过扩增效率（90%-110%）、相关系数R2（≥0.99）以及回收率（90%-110%）评价5组引物和探针的定量分析能力，分析引物和探针的特异性和保守性与定量分析能力之间的关系； （七） 相关数据已经进行论文投稿以及专利申请。目前发表SCI论文2篇，在投稿SCI论文3篇，中文核心论文8篇，申请国家发明专利8项（授权1项）。
最终通过上述实验确定绵羊和山羊源性成分同步检测的引物和探针以及绝对灵敏度（1 pg）和相对灵敏度（0.1-1%）。此方法具有绵羊和山羊源性的特异性，来源于绵羊和山羊的肉乳样品均出现相
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