标”一直是上述的活检穿刺, 但由于活检穿刺费用高且有创、痛苦, 不易为病人接受, 而且穿刺本身具有危险性, 不宜多做, 故移植后在医生未察觉的情况下突然因排斥反应使移植器官失去功能而导致病人死亡情况屡有发生。再如, 许多病人在移植后, 由于经济原因而停用免疫抑制剂, 结果发现其中有些病人停药后并不发生排斥反应, 也就是说这些病人对供体器官产生了免疫耐受，在未停药的患者中，实际上可能有不少患者已对供体器官产生了耐受。然而，由于没有一个科学的指标去检测并说明该患者已对供体器官产生了耐受，所以，医生很难确定停用免疫抑制剂的时机，从而，使移植后停用免疫抑制剂成为一种冒险。因此，本方法将对器官移植前的供受体选择、移植后的排斥反应的确定以及停用免疫抑制剂时机的掌控有革命性的贡献。 器官移植是治疗许多器官终末期疾病的唯一方法。在器官移植后，供受体间HLA抗原的差异将引起排斥反应，排斥反应仍是目前影响心、肝、肾、骨髓等器官或细 胞移植后1年、5年、10年存活率的主要因素， 如果有一个在移植以前可以挑选供受体使之合理搭配(即挑选那些移植后可能发生排斥反应较轻或不发生排斥反应的供受体进行移植, 这一点对骨髓移植尤为重要)、在移植后能检测有无排斥反应发生、移植器官有无淋巴细胞慢性浸润及受体对供体器官有无免疫耐受发生等的无创检测方法, 对指导临床医生合理调整免疫抑制剂用量、使之适时停药(将大大减轻病人的经济负担), 提高病人生存质量，降低移植病人的死亡率, 延长移植器官的存活时间具有重要意义, 这将有力推动器官移植事业的发展。 所以, 随着接受器官移植的患者的不断增加及移植免疫学的迅速发展, 建立一套完善的移植前对供受体选择, 移植后监测受体对供体特异性免疫状态的无创检测方法, 对供体器官的长期存活已变得越来越重要。但在本方法出现以前, 临床上尚没有一个快捷、敏感、特异、可靠、无创的科学的指标来指导移植前供体的挑选, 移植后排斥反应和免疫耐受的诊断,及免疫抑制剂用量调整的方法。
2．主要研究开发内容、拟解决的技术难点、创新突破点以及预期达到的目标、主要经济技术指标和水平（不限字数） 2.1本项目研究开发的主要内容： 将传统免疫学检测方法和现代分子生物学技术有机结合，建立一套可应用于临床器官移植排斥反应预测的快捷、敏感、特异、可靠、无创的科学方法；在进行传统免疫学研究过程中建立一个全新的免疫学方法，应用于排斥反应的临床诊断。主要研究内容有： (1)排斥反应预测： 它是运用分子生物学技术，建立表达HLA-Ⅰ类和Ⅱ类抗原的标准细胞株，使每株细胞上只表达一个HLA抗原。再把这些几乎包含了人类全部HLA抗原的细胞株的细胞分别放入细胞培养板各孔之中，制成标准细胞板作为抗原板，用该抗原板通过混合淋巴细胞培养方法来检测受体对哪些HLA抗原反应强、对哪些HLA抗原反应弱，从而指导我们为受体挑选合适的供体器官，以减少移植后排斥反应的发生。其主要研究内容包括： A、HLA抗原缺失细胞系（作为HLA抗原表达的空白细胞载体）的选择与鉴定，已完成。 B、通过EB病毒感染的方法建立包含已知人类全部HLA抗原的几十个细胞系（该项工作已经基本完成），并分别从这些细胞中提取mRNA进行反转录，再通过PCR方法从反转录的cDNA中克隆出目的基因进行测序，该项工作正在进行中，已经完成了其中一部分。 C、选择一种能在真核细胞中表达、并且能整合到宿主细胞基因组中的逆转录病毒表达载体， 构建HLA抗原表达载体，该项工作正在进行中（已构建出10余个抗原表达载体）。 D、把HLA抗原表达载体经包装后转染入细胞中表达（正在进行中）。 E、筛选稳定表达某一个HLA抗原的细胞建株、并进行鉴定。 F、重复上述工作，建立分别表达不同HLA抗原近100个亚型抗原的细胞株。 G、探索用这些细胞株作为刺激细胞进行混合淋巴细胞反应的最佳条件。
H、建立这些细胞株的大规模培养条件，用这些细胞制备包含人类全部HLA抗原的检测板。 I、用这种HLA抗原检测板，通过混合淋巴细胞反应为器官移植受者挑选供体，同时对移植后的患者进行监测，发现已对供体器官产生免疫耐受的患者，并指导其逐渐停用免疫抑制剂。 J、建立用这些细胞株作为刺激细胞进行混合淋巴细胞反应抑制试验的最佳条 件。 (2)排斥反应等的诊断： 在进行移植免疫学的研究过程中，我们又建立了一个全新的免疫学方法，由于其实验方法与混合淋巴细胞反应相似，反应结果和混合淋巴细胞反应结果完全相反，暂时我们把它叫做混合淋巴细胞反应抑制试验，该实验可以用来检测外周血中活化淋巴细胞的特异性，故使用上述HLA抗原板即可检测器官移植受者体内有无HLA抗原活化的淋巴细胞，从而判断体内有无排斥反应发生。该方法不但可以用于诊断排斥反应，也可能用于各种传染病的诊断和预防。 ⑴挑选上述已被EB病毒转化的细胞株中相互不具有相同抗原的细胞株，以他们为载体，通过上述基因工程的方法，把其它的未包含在所挑选的载体中的HLA抗原分别转入其中并表达，使一个细胞表达尽可能多的HLA抗原。从而使这些细胞株表达几乎人类全部的HLA抗原。 ⑵用这些表达较多HLA抗原的细胞株制备HLA抗原板，通过混合淋巴细胞反应抑制试验对器官移植病人进行排斥反应监测,并探索其最佳反应条件。 ⑶选择上述两种细胞板中的一种细胞板进行混合淋巴细胞反应抑制试验，对器官移植后的患者进行排斥反应监测、诊断和预防。 ⑷对混合淋巴细胞反应抑制试验方法在临床感染性疾病诊断方面的应用进行探索性研究，争取早日把该方法应用到流脑、乙脑病毒、出血热病毒、水痘病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒、SARS病毒等疾病的诊断和感染性疾病疫苗接种后的免疫效果评价方面。 2.2 拟解决的技术难点： （1） 建立、筛选稳定表达单一HLA抗原的各种细胞株。 （2） 表达HLA抗原的细胞株的大规模培养技术。
2.3创新突破点： （1）利用基因工程技术建立百余种分别只表达一种HLA抗原的标准细胞株，把这些细胞株和传统免疫学技术结合建立人类混合淋巴细胞反应板，在世界上首次建立一个世界通用的、体外检测一个个体对每个HLA抗原反应性的方法。该方法已获国家发明专利（见附件）。 （2）建立了一个全新的、可以用来检测机体内活化淋巴细胞特异性的免疫学方法（目前世界上还没有一个检测体内活化淋巴细胞特异性的方法），并在世界上推广该方法用于排斥反应的诊断和预防。 2.4预期达到的目标 2.4.1 过2-3年的工作，完成上述HLA-Ⅰ类抗原、HLA-‖类抗原近100个亚型抗原的表达、并使之具备生产条件。 2.4.2 通过3-4年的工作，用于移植前挑选供、受体使之合理搭配的检测试剂盒，用于移植后排斥反应监测、诊断的试剂盒均拿到生产批号，投放并满足国内市场的需求，同时开始进军国外市场。 2.5主要技术指标和水平： 2.5.1主要技术指标： （1）表达10多种和表达单种HLA抗原的细胞株，具有稳定表达、传代能力。 （2）移植前用于预测，可以了解一个个体对每个HLA抗原分子的反应性；移植后用于诊断，可以确定受体对供体所含抗原有无免疫耐受发生。 （3）移植后用于诊断，不但可以确定排斥反应的发生与否，而且还可以确定受体对哪一个HLA抗原产生了排斥反应，精确到每一种抗原亚型。 （4）建立哺乳动物细胞大规模培养的技术平台，建立和掌握50升、300升动物细胞大规模培养的技术条件。 2.5.2 水平： ①预测、诊断排斥反应的试剂盒达到世界领先水平。 ②有关细胞大规模培养的技术达到国内先进水平。 2.6 经济指标 ：
①预测、诊断排斥反应的试剂盒国内上市后年利税达到一亿元人民币。出口年创汇4-6亿美金。 ②各种传染性疾病检测试剂盒投放市场后，可创造不少于排斥反应检测试剂盒所能创造的效益。 综上分折，本项目预计投资5000万元，首期投资需1000-1500万元人民币。投资到位后18-24个月可具备批量投产条件，生产能力为年产80万套，投产一年后年产150万套。届时，年销售收入20亿元人民币，税收3亿元人民币，净利润8亿元人民币。产品上市后一年可收回全部投资。
某生物技术科技项目建议书
