生物化学实验三血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳

由天下分享时间：2024/7/4 1:53:42 加入收藏我要投稿点赞

实验三血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳

一、目的要求

学习和掌握电泳技术的基本原理；学习掌握醋酸纤维薄膜电泳的操作。二、实验原理

蛋白质是两性电解质。在pH小于其等电点的溶液中蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动；在pH大于其等电点的溶液中，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动。血清中含有的蛋白质等电点大部分低于pH 7.0，所以在缓冲液(pH 8.6)中，它们都电离成负离子，在电场中向阳极移动。

醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法。。醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成，它具有均一的泡沫样结构，厚度仅120um，有强渗性，对分子移动无阻力，作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速、样品用量少，应用范围广，分离清晰，没有吸附现象等优点。目前已广泛应用于血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白和同工酶的分离。三、材料、器材与试剂 1〉材料

马血清样品 2〉器材

醋酸纤维薄膜(2cm×8cm)、常压电泳仪、点样器、培养皿、粗滤纸、玻璃板、镊子。 3〉试剂

(1)硼酸缓冲液(pH 8.6，离子强度0.075)：称取硼酸5.6025g、硼砂5.6099g、氧化钠1.3163g，加水至1000ml。

(2)染色液：含氨基黑10B 0.25g、甲醇(A.R)50ml、冰醋酸10ml、水40ml(可重复使用)。 (3)漂洗剂：含甲醇或乙醇45ml、冰醋酸5ml、水50ml，混合即可得100ml。 (4)透明性：无水乙醇70ml、冰醋酸30ml。四、实验步骤

(1)浸泡：用镊子取醋酸纤维薄膜1张(识别出光泽面和粗糙面，并在光滑面角上用笔做上记号)放在缓冲液中浸泡20min。

(2)点样：把膜条从缓冲液中取出，用滤纸吸干膜条表面多余的液体，然后平铺在玻璃板上(粗糙面朝上)，用玻棒蘸一点血清，再将点样器沾一下玻棒，则血清就会均匀地分布在点样器上，将点样器在膜条一端2~3cm处轻轻、水平地落下并随之提起，这样在膜条上点上了细条状的血清样品。

(3)电泳：先剪裁一些尺寸合适的滤纸条，取双层滤纸条附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内。用缓冲液将滤纸全部湿润并驱除气泡，使滤纸条紧贴在支架上，即为滤纸桥。

在电泳槽内加入缓冲液，缓冲液液面离膜条距离1.5~2cm，使两个电极槽内液面等高，将膜条平悬于电泳槽支架的滤纸桥上，膜条上点样的一端靠近负极。盖严电泳室，通电，调节电压至100~160V，电流强度0.4~0.7mA/cm膜宽，电泳时间为60~90min。

(4)染色：电泳完毕后将膜条取下来并放在染色液中浸泡10min。 (5)漂洗：将膜条从染色液中取出来后移置到漂洗液中漂洗。五、结果处理

(1)将膜条漂洗至无蛋白区底色脱净为止，可得色带清晰的电泳图谱。

(2)定量测定时可将膜条用滤纸压平吸干，按区带分段剪开，分别浸在0.4mol/L氢氧化钠溶液中半小时，并剪取相同大小的无色带膜条作为空白对照，在A560条件下进行比色。或者将干燥的电泳图谱膜条放入透明液中浸泡2~3min后取出贴于洁净玻璃板上，干后即为

透明的薄膜图谱，可用光密度计直接测定A560。