HPLC 法测定婴幼儿营养米粉中泛酸的含量
作者：曾金林,王加胜,周 斌
来源：《现代食品》 2019年第10期
◎ 曾金林,王加胜,周?斌
(杭州市食品药品检验研究院,浙江?杭州?310022)
Zeng Jinlin, Wang Jiasheng, Zhou?Bin
(Hangzhou Institute for Food and Drug Control, Hangzhou?310022, China)
摘?要:本文建立了利用HPLC法测定婴幼儿米粉中泛酸含量的方法。色谱柱:Kinetex C18 2.6 μm,4.6×100 mm;流动相:0.02 mol·L-1磷酸二氢钾溶液∶甲醇=95∶5;流速:1 mL·min-1;柱温:35 ℃;进样量:20 μL;二极管矩阵检测器,检测波长200 nm。方法在0.861 2~8.612 1 μg·mL-1范围内线性良好,相关系数R2=0.999 946 6,泛酸加标回收率平均值97.6%,样品测定精密度RSD为2.54%。
关键词:婴幼儿营养米粉;泛酸;高效液相色谱
Abstract:A HPLC method was adapted for the assay of pantothenic acid in infant nutrition rice powder. The chromatographic system included a Kinetex C18 column (2.6 μm 4.6×100 mm) and a mobile phase consisting of Potassium dihydrogen
phosphate aqueous solution and methanol(95∶5),with a flow rate of 1 mL·min -1and 20 μL sample amount. The system was monitored by diode matrix detector at 200 nm.The system was linear from 0.861 2~8.612 1 μg·mL-1 and the relative
coefficient was 0.999 946 6. The average recovery rate was 97.6%, the value of RSD was 2.54%.
Key words:Infant nutrition rice powder; Pantothenic acid; HPLC
中图分类号:TS216
泛酸是一种B族维生素,又名维生素B5,因广泛存在于自然界而得名[1]。泛酸是由泛解酸和β-丙氨酸组成的一种化合物,分子式为C9H17O5N,分子量219。泛酸的主要生理功能是构成辅酶A和酰基载体蛋白,并通过它们在代谢过程中发挥作用,同时也是参与人体中类固醇、褪黑激素、抗体和亚铁血红素合成的重要物质[2]。作为影响人类身体正常生理机能所必需的小分子有机物,泛酸对人体的健康尤其是在婴幼儿的生长发育过程中有着不容忽视的作用。国家标准GB 10765-2010对婴幼儿乳及乳制品中泛酸的添加具有强制标准,而作为婴幼儿辅食的米粉,在国家标准
GB 10769-2010的5.4中,泛酸作为一种可选择的营养成分指标,添加泛酸含量应不小于
50.4 μg/100 kJ。目前,泛酸的测定方法有紫外分光光度法、比色法、微生物法、气相色谱法、液质法等[3-9],但这些方法存在时间跨度长、操作不够简单、仪器要求较高等不足。本文采用高效液相色谱法,对营养米粉中的泛酸检测进行了研究。
1?材料与方法
1.1?仪器
高效液相色谱仪:岛津 LC20AD,二极管矩阵检测器;Neofuge 15R离心机:上海力申;FE20酸度计:梅特勒;ZWY-110×50恒温水浴振荡器:上海智城。
1.2?试剂
0.02 mol·L-1磷酸二氢钾溶液:称取2.72 g磷酸二氢钾(AR级),加500 mL水溶解,用磷酸调节pH值至3.0,用水定容至1 000 mL,0.45 μm滤膜过滤;0.05 mol·L-1硫酸锌:称取14.4 g七水合硫酸锌(AR级),加水溶解并定容至100 mL;乙腈:色谱纯,默克;甲醇:色谱纯,默克;淀粉酶;SIGMA,酶活力≥100 U·mg-1;泛酸钙标准品:购于中国食品药品检定研究院,纯度97.5%。
准确称取25 mg左右泛酸钙,溶于25 mL容量瓶中,配制成约1 mg·mL-1泛酸钙标准储备液。用水稀释适当倍数,供实验用,做标准曲线(注:泛酸含量=泛酸钙含量/1.087,实际配得泛酸标准工作液浓度8.612 1μg·mL-1)。
1.3?测定方法
1.3.1?样品前处理
准确称取试样5 g,置于锥形瓶中,加入40~50 ℃
温水30 mL,加入淀粉酶0.1 g,振摇混匀,于55 ℃水浴振荡酶解240 min。取出冷却至室温,用0.1 mol·L-1
盐酸调节pH至5.0,加入5 mL硫酸锌溶液,混匀,定容至50 mL。转入离心管以4 000 r·min-1离心5 min,上清液过0.45 μm滤膜待上机。
1.3.2?色谱条件
色谱柱:①ACE Excel 5 C18 4.6×250 mm;②Kinetex
C18 2.6μm 4.6×100 mm。流动相:①0.02 mol·L-1磷酸二氢钾溶液∶乙腈=95∶5。②0.02 mol·L-1磷酸二氢钾溶液∶乙腈=90∶10。③0.02 mol·L-1磷酸二氢钾溶液∶甲醇=95∶5。④0.02 mol·L-1磷酸二氢钾溶液∶甲醇=90∶10。流速:1 mL·min-1。进样量:20 μL;柱温:35 ℃。检测波长:①200 nm;②205 nm;③210 nm。
2?结果与讨论
2.1?检测波长的选择
国家标准《食品中泛酸的测定》(GB 5009.210-2016)
中,检测波长为210 nm,但在实验过程中,发现在200 nm处泛酸有更好的光谱吸收值。在营养米粉中,泛酸含量普遍不高,而且基质干扰又比较大。在这时,光谱当中有个大的信号值,对结果的准确性和稳定性都很有帮助。我们对标样的信号值做了比较,见表1,最终选择200 nm作为检测波长。
2.2?色谱柱的选择
对菲罗门的C18 5 μm 250 mm长柱和2.6 μm
100 mm超高压短柱两种色谱柱进行比较,流动相为0.02 mol·L-1磷酸二氢钾溶液∶甲醇=95∶5,流速
1 mL·min-1,柱温35 ℃,色谱图如图1~4所示。从图1~图4可发现,长柱的保留时间为17.29 min,短柱的保留时间3.29 min,且短柱的峰形更好,分离效果更佳。短柱出峰时间的极大缩短,可节省实验时间,节约流动相和化学试剂,保护仪器及检测器灯管的使用寿命,选短柱更佳。
2.3?流动相的选择
同时选择4种不同通比例的流动相,2.6 μm
100 mm短柱,流速1 mL·min-1,柱温35 ℃,出峰时间见表2。
从表2可以发现,虽然乙腈的洗脱分离效果好,出峰时间短,但是泛酸目标峰未能与溶剂峰和基质峰很好地分离,受营养米粉中蛋白质、淀粉、脂肪等基质峰干扰较大。而选用极性较小一些的甲醇来代替乙腈,在0.02 mol·L-1磷酸二氢钾溶液∶甲醇=95∶5时,泛酸的出峰时间为
3.294 min,完全避开了3 min前的主要基质峰干扰,与相邻峰的分离度为2.18,完全能达到分离效果。另外,相较于乙腈,甲醇对人体毒害小,价格低。所以选用0.02 mol·L-1磷酸二氢钾溶液∶甲醇=95∶5作为流动相较为理想。
2.4?标准曲线的线性
根据营养米粉中泛酸测定的实际需要,在0.861 2~8.612 1 μg·mL-1建立了以峰面积为纵坐标,以浓度为横坐标的标准曲线,见表3和图5。
HPLC 法测定婴幼儿营养米粉中泛酸的含量
