MIR-145通过靶向EGFR和NUDT1抑制人肺腺癌细胞增殖
参考文献:William c.s. cho,* Andrew s.c. chow and Joseph s.K. Au. MiR-145 inhibits cell proliferation of human lung adenocarcinoma by targeting EGFR and NUDT1. RNA Biology 8:1, January/February 2011, 125-131.
摘要： 小RNA（miRNA）是新兴的具有重要调节功能的RNA,它们的出现在肿瘤发生中也发挥着关键作用。 MIR-145在几种人类恶性肿瘤中表达下调，包括肺癌，但其分子机制仍不清楚。我们曾报道过，hsa-miR-145能够抑制癌细胞的生长，对于表皮生长因子受体（EGFR）突变的肺腺癌患者。这项研究表明，hsa-miR-145针对肺腺癌细胞EGFR和二磷酸核苷相连部分的X- 1（NUDT1或MTh1）。 EGFR和NUDT1的mRNA表达对人肺腺癌细胞的miR-145转染后显著下调。我们的研究结果证实了miR-145对EGFR和NUDT1表达无论是在mRNA还是蛋白水平都是负调控。进一步分析发现，miR-145在这三个时间点（24，48和72小时），具有抑制转染肺腺癌细胞的细胞增殖能力。miR-145的上调似乎是肺腺癌细胞增殖的重要基因调控机制，它与EGFR和NUDT1的下调密切相关。有趣的是，我们的研究显示，改变肺癌细胞的增殖不伴随细胞凋亡的变化。我们的发现提供了新的对复杂的调节通路的深刻理解，包含miR-145，EGFR，NUDT1和其他对细胞增殖而不是细胞凋亡的未知因素，。了解miR-145的作用靶点及其调控通路可能产生对肺腺癌新的治疗策略。 方法:
1,细胞转染miR-145或miRNA阴性对照
miR-145表达载体（miRNASelect PEP-的miR-145）和miRNA的阴性对照载体（miRNASelect PEP-MIR空控制）购自Cell Biolabs公司（圣地亚哥，CA获得 美国）。所有肺腺癌细胞系根据制造商说明(QIAQEN，德国希尔登）使用双倍体转染试剂转染PEP-miR-145或PEP-MIR-null。除非另有说明，1微克DNA载体在100微升缓冲液稀释混合加8微升增强剂温育2分钟。将5微升的双倍转染试剂加入到DNA的增强剂混合物中，并温育10分钟，使转染复合物形成。在复合物形成期间，用含有10％（V / V）FCS的2.5毫升不含抗生素的培养基代替正常生长所用的培养基。然后将转染复合物施加到细胞，并培养72小时。转染72小时后，用qRT-PCR分析转染效率。
2. RNA提取和mRNA 与miR-145的定量RT-PCR分析
根据制造商的说明，使用Trizol试剂盒（Invitrogen公司，卡尔斯巴德，CA USA）提取肺腺癌细胞中总RNA。采用实时定量RT-PCR获得的miR-145转染后表达的准确定量。简言之，使用TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems公司，福斯特城，CA USA）从总RNA样品（10毫微克）逆转录得到cDNA。每个miRNA反转录（RT）反应包括RT缓冲液，1mM deoxynu-核苷酸三磷酸，5个单位的MultiScribe反转录酶（Applied Biosystems），核糖核酸酶抑制剂和RT引物。将反应管在16℃下培养30分钟，42℃下培养30分钟，85℃下进行5分钟，最后4℃培育5分钟。RT产物取20ul进行PCR，反应条件为95℃ 10分钟，接着进行95℃ 15秒，60℃60秒达40个循环。标准化的数据为TaqMan内源性控制RNU48仪（Applied Biosystems）的表达。miR-145的相对定量表达水平通过C T法来测定，分析mRNA。 3.免疫印迹分析
用裂解缓冲液将所有转染肺腺癌细胞进行裂解（50毫摩尔Tris盐酸，pH值7.5;150毫摩尔NaCl，用1％的Triton X-100;0.1％十二烷基磺命运;0.25％的脱氧胆酸钠）
缓冲液中含有蛋白酶抑制剂混合物（Sigma公司-Aldrich公司，圣路易斯，密苏里州美国）。蛋白浓度通过BCA蛋白质测定试剂盒（Pierce化学公司，罗克福德，IL USA）定量。简言之，用4-12％的Bis-Tris十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并印迹至0.2μm的硝酸纤维素膜，分离细胞裂解物蛋白（15微克）。印迹固定室温2小时，然后在4℃与每个初级抗体孵育过夜[抗EGFR，抗NUDT1，抗聚ADP-核糖聚合酶（PARP）接着二抗孵化，通过柯达影像站进行蛋白质检测和定量。用Western印迹回收试剂盒（微孔公司，比尔里卡，MA USA）进行印迹剥离，以重新探测不同的抗体。 β肌动蛋白用作上样对照。 4.细胞增殖分析。
根据CellTiter 96 AQ ueous水性单溶液细胞增殖试验测定细胞增殖（Promega公司，麦迪逊，WI USA），甲臜产物的量与培养的活细胞的数量成正比，简言之，NCI-H1975细胞（0.6×105）接种到24孔板的每个孔中，并在37℃下在5％CO 2的潮湿培养箱保持在正常生长培养基中24小时。当细胞达70％，将它们与miRNA的载体进行转染。A 0.2微克载体DNA在60微升extracel-与1.6微升增强剂混合，并温育2分钟细胞性缓冲液稀释。 2微升的双倍转染试剂（QIAQEN）加到该DNA会混有增强剂的混合物中温育10分钟，形成转染复合物。在复合物形成过程中，用含有10％（V / V）FCS的0.5毫升不含抗生素的培养基代替正常生长培养基。然后将转染复合物加入到细胞中并在转染后24小时，48小时和72小时收集样品。在每个时间点，细胞存活率使用MTS测定试剂盒（Promega公司）进行评估。将MTS试剂加入到培养基（1/5稀释）并在490nm波长测定吸光度OD值。 5. 生物信息学分析和HSA-miR-145目标预测
MIR-145通过靶向EGFR和NUDT1抑制人肺腺癌细胞增殖
