MIR-145通过靶向EGFR和NUDT1抑制人肺腺癌细胞增殖
参考文献:William c.s. cho,* Andrew s.c. chow and Joseph s.K. Au. MiR-145 inhibits cell proliferation of human lung adenocarcinoma by targeting EGFR and NUDT1. RNA Biology 8:1, January/February 2011, 125-131.
摘要: 小RNA(miRNA)是新兴的具有重要调节功能的RNA,它们的出现在肿瘤发生中也发挥着关键作用。 MIR-145在几种人类恶性肿瘤中表达下调,包括肺癌,但其分子机制仍不清楚。我们曾报道过,hsa-miR-145能够抑制癌细胞的生长,对于表皮生长因子受体(EGFR)突变的肺腺癌患者。这项研究表明,hsa-miR-145针对肺腺癌细胞EGFR和二磷酸核苷相连部分的X- 1(NUDT1或MTh1)。 EGFR和NUDT1的mRNA表达对人肺腺癌细胞的miR-145转染后显著下调。我们的研究结果证实了miR-145对EGFR和NUDT1表达无论是在mRNA还是蛋白水平都是负调控。进一步分析发现,miR-145在这三个时间点(24,48和72小时),具有抑制转染肺腺癌细胞的细胞增殖能力。miR-145的上调似乎是肺腺癌细胞增殖的重要基因调控机制,它与EGFR和NUDT1的下调密切相关。有趣的是,我们的研究显示,改变肺癌细胞的增殖不伴随细胞凋亡的变化。我们的发现提供了新的对复杂的调节通路的深刻理解,包含miR-145,EGFR,NUDT1和其他对细胞增殖而不是细胞凋亡的未知因素,。了解miR-145的作用靶点及其调控通路可能产生对肺腺癌新的治疗策略。 方法:
1,细胞转染miR-145或miRNA阴性对照
miR-145表达载体(miRNASelect PEP-的miR-145)和miRNA的阴性对照载体(miRNASelect PEP-MIR空控制)购自Cell Biolabs公司(圣地亚哥,CA获得 美国)。所有肺腺癌细胞系根据制造商说明(QIAQEN,德国希尔登)使用双倍体转染试剂转染PEP-miR-145或PEP-MIR-null。除非另有说明,1微克DNA载体在100微升缓冲液稀释混合加8微升增强剂温育2分钟。将5微升的双倍转染试剂加入到DNA的增强剂混合物中,并温育10分钟,使转染复合物形成。在复合物形成期间,用含有10%(V / V)FCS的2.5毫升不含抗生素的培养基代替正常生长所用的培养基。然后将转染复合物施加到细胞,并培养72小时。转染72小时后,用qRT-PCR分析转染效率。
2. RNA提取和mRNA 与miR-145的定量RT-PCR分析
根据制造商的说明,使用Trizol试剂盒(Invitrogen公司,卡尔斯巴德,CA USA)提取肺腺癌细胞中总RNA。采用实时定量RT-PCR获得的miR-145转染后表达的准确定量。简言之,使用TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems公司,福斯特城,CA USA)从总RNA样品(10毫微克)逆转录得到cDNA。每个miRNA反转录(RT)反应包括RT缓冲液,1mM deoxynu-核苷酸三磷酸,5个单位的MultiScribe反转录酶(Applied Biosystems),核糖核酸酶抑制剂和RT引物。将反应管在16℃下培养30分钟,42℃下培养30分钟,85℃下进行5分钟,最后4℃培育5分钟。RT产物取20ul进行PCR,反应条件为95℃ 10分钟,接着进行95℃ 15秒,60℃60秒达40个循环。标准化的数据为TaqMan内源性控制RNU48仪(Applied Biosystems)的表达。miR-145的相对定量表达水平通过C T法来测定,分析mRNA。 3.免疫印迹分析
用裂解缓冲液将所有转染肺腺癌细胞进行裂解(50毫摩尔Tris盐酸,pH值7.5;150毫摩尔NaCl,用1%的Triton X-100;0.1%十二烷基磺命运;0.25%的脱氧胆酸钠)
缓冲液中含有蛋白酶抑制剂混合物(Sigma公司-Aldrich公司,圣路易斯,密苏里州美国)。蛋白浓度通过BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce化学公司,罗克福德,IL USA)定量。简言之,用4-12%的Bis-Tris十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并印迹至0.2μm的硝酸纤维素膜,分离细胞裂解物蛋白(15微克)。印迹固定室温2小时,然后在4℃与每个初级抗体孵育过夜[抗EGFR,抗NUDT1,抗聚ADP-核糖聚合酶(PARP)接着二抗孵化,通过柯达影像站进行蛋白质检测和定量。用Western印迹回收试剂盒(微孔公司,比尔里卡,MA USA)进行印迹剥离,以重新探测不同的抗体。 β肌动蛋白用作上样对照。 4.细胞增殖分析。
根据CellTiter 96 AQ ueous水性单溶液细胞增殖试验测定细胞增殖(Promega公司,麦迪逊,WI USA),甲臜产物的量与培养的活细胞的数量成正比,简言之,NCI-H1975细胞(0.6×105)接种到24孔板的每个孔中,并在37℃下在5%CO 2的潮湿培养箱保持在正常生长培养基中24小时。当细胞达70%,将它们与miRNA的载体进行转染。A 0.2微克载体DNA在60微升extracel-与1.6微升增强剂混合,并温育2分钟细胞性缓冲液稀释。 2微升的双倍转染试剂(QIAQEN)加到该DNA会混有增强剂的混合物中温育10分钟,形成转染复合物。在复合物形成过程中,用含有10%(V / V)FCS的0.5毫升不含抗生素的培养基代替正常生长培养基。然后将转染复合物加入到细胞中并在转染后24小时,48小时和72小时收集样品。在每个时间点,细胞存活率使用MTS测定试剂盒(Promega公司)进行评估。将MTS试剂加入到培养基(1/5稀释)并在490nm波长测定吸光度OD值。 5. 生物信息学分析和HSA-miR-145目标预测
MIR-145通过靶向EGFR和NUDT1抑制人肺腺癌细胞增殖
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