铜绿假单胞菌外排泵及整合子与碳青霉烯类耐药中的关系
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李 翔，陈 辉，伍 勇，漆 涌，陈 体
【摘 要】目的 明确金属酶、整合子和外排泵在铜绿假单胞菌碳青霉烯类耐药中的作用。方法 对42株泛耐药铜绿假单胞菌采用K－B法检测MIC值，双纸片扩散法测金属β－内酰胺酶（MBL），PCR扩增整合子并测序基因盒，real－ti me PCR检测opr M基因表达，western blot检测外膜蛋白。结果 亚胺培南耐药率高达45.23%，美罗培南耐药率71.42%；检出有22株产MBL；Ⅰ类整合子检出率52.30%，携带dhfrⅫ－orf F－aad A2和aac A4－bla VI M－4两种类型的基因盒组合形式；opr M基因高表达细菌是低表达细菌的3.56倍；25株高表达Mex AB－Opr M外膜蛋白。结论 金属酶、整合子均不是铜绿假单胞菌对碳青霉烯类耐药的主要原因，Mex AB－Opr M高表达致美罗培南耐药。各种耐药机制相互影响，并相互协同。 【期刊名称】国际检验医学杂志 【年(卷),期】2011(032)001 【总页数】3
【关键词】整合子类； 细菌外膜蛋白质类； 金属蛋白酶； 假单胞菌铜绿； 碳青霉烯类
铜绿假单胞菌是院内感染常见致病菌，由于广谱抗生素的广泛应用，加之铜绿假单胞菌对多种抗生素存在天然和获得性的多重耐药，出现了多药耐药菌株（MDRPA），甚至泛耐药菌株，给由此导致的感染治疗加深了难度。碳青酶烯类抗生素通常被用作治疗多药耐药铜绿假单胞菌感染，然而，随着临床广泛应
用，对其耐药的铜绿假单胞菌比例也有所增加。鉴于其复杂的耐药机制，本文从产金属β－内酰胺酶（MBL）、外排泵高表达及整合子传递耐药性三方面，分析铜绿假单胞菌对碳青酶烯类抗生素的耐药机制，并分析三者之间的相互作用机制，并报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料 收集2007年1～7月本科微生物室分离所得的铜绿假单胞菌多药耐药株（排除同一患者同一部位重复分离的菌株）42株。其中痰标本33株，创面分泌物标本5株，血液标本2株，胸水标本2株。菌种鉴定采用Vitek2系统（Bio Merieux，法国），亚胺培南、美罗培南由杭州默沙东制药有限公司生产。药敏判定标准按照美国临床和实验室标准协会（CLSI 2006）规定，以铜绿假单胞菌（ATCC27853）为质控菌株。O1群霍乱弧菌SK10为第一类整合子阳性对照；E.coli C600为阴性对照由华南理工大学轻工与食品学院石磊教授提供。 1.2 仪器及试剂 Mini Gel电泳槽、Mini－PROTEIN Ⅱcell电泳仪、转印槽均购自美国Bio－RAD公司，GDS－800 UVP凝胶成像系统为美国 UV 公司产品，real ti me PCR仪（Eppendorf，德国）。Opr M 多克隆抗体（一抗）由 Tokai University School of Medicine，Japan，Eisaku Yoshihara教授惠赠，羊抗兔二抗购自北京中杉金桥生物技术公司。引物合成及测序均交上海生工公司。
1.3 方法 （1）双纸片协同实验检测金属酶：参照文献［1］报道的方法，采用EDTA协同实验，加EDTA的抑菌圈直径比不加的大于或等于5 mm判断为MBL阳性。（2）PCR检测整合子：菌种复苏增殖后，采用煮沸裂解法提取细菌总DNA。分别以Ⅰ类整合酶（上游5′GGT CAA GGA TCT GGA TTT CG 3′，
下游5′ACA TGC GTG TAA ATC ATC GTC 3′）和整合子可变区（上游5′GGC ATC CAA GCA GCA AG 3′，下游5′AAG CAG ACT TGA CCT GA 3′）设计引物扩增Ⅰ类整合子和整合子可变区［2］。限制性片段长度多态性（RFLP）分析整合子基因盒插入区的扩增片段，经HinfⅠ核酸内切酶酶切后电泳分析其类型。同一大小整合子可变区扩增片段经HinfⅠ酶切后，若得到相同的酶切图谱，可以推知同样大小的基因盒片段是相同的DNA序列。取不同大小的整合子可变区PCR产物送测序。（3）外 排 泵 Mex AB－Opr M 的 opr M 的real－time PCR：采用 TransStart Green q PCR Super Mix UDG试剂盒（北京全氏金公司）。opr M 引物序列（上游5′CCA TGA GCC GCC AAC TGT C 3′，下游5′CCT GGA ACG CCG TCT GGA T 3′）。原核生物已知的16 s DNA作内参照基因。反应条件：95℃7 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 40 s，40个 循 环；72℃40 s，荧光信号于72℃读取采集。（4）外膜蛋白提取：从血平板上挑取纯菌落到LB培养液中，振荡，过夜，培养至对数生长期。以离心半径8 c m 7 000 r／min 4℃离心10 min，收集细菌，用PBS洗涤并悬浮细菌。置冰浴超声碎菌10 min，每次0.5 min，间隔5 s，频率为6 kg。以离心半径8 c m 7 000 r／min 4℃离心15 min，弃未破碎细胞。取上清液，以离心半径8 c m 10 000 r／min 4℃离心2 h，弃上清，将沉淀颗粒悬浮于1 mL PBS中（内含2%十二烷基磺酸钠SDS），室温作用30 min，将此悬液室温离心1 h，弃上清，并用1%SDS洗涤1次。离心提纯后的外膜蛋白依据量的多少悬浮于20～60μL PBS中。用紫外光分光光度计测吸光度A，采用公式：蛋白浓度（mg／mL）＝1.5×A 280－0.75×A 260，将蛋白浓度调至40 mg／mL。（5）Wester n印记：取50 mg蛋白，经SDS－PAGE电泳后转移到硝酸纤维素膜
铜绿假单胞菌外排泵及整合子与碳青霉烯类耐药中的关系
