蛋白互作技术是植物保护、细胞生理等领域的关键实验技术，重组蛋白的质量对实验结果具有重要影响。高质量的重组蛋白必然是“拟真”的，靶蛋白的空间结构（如二硫键成键）及蛋白修饰情况（乙酰化、磷酸化、糖基化）要尽量与天然状态保持一致，才能提供足够高的亲和力与候选蛋白发生相互作用。由于自然条件下的靶蛋白修饰情况往往未见报道，追求绝对“拟真”并不现实，在蛋白互作实验中保证重组蛋白正确折叠即可。下面对重组蛋白表达的一些常见问题进行梳理。
Q1：毕赤酵母表达系统最“直观”的优势是什么？
毕赤酵母的分泌表达成功率约为80%左右，远高于大肠杆菌（低于10%）。另一方面，毕赤酵母发酵液上清的杂蛋白较少（见图1A），因此亲和层析纯化的成功率极高（超过95%，不会出现大肠杆菌中“能表达但不能挂柱”的情况），易于获得纯化蛋白进行下游实验。最后，未经优化的酵母表达产量较大可能低于大肠杆菌，但通过使用高效表达元件、提高目的基因拷贝数、共表达分子伴侣后，重组蛋白的产量可比优化前提高3-8倍。通过使用高密度发酵技术，又可在此基础上继续提高8-10倍。最终将重组蛋白产量提高至理想水平。
图1 多拷贝策略对犬α干扰素产量的影响
(A) 摇瓶发酵上清的SDS-PAGE检测。泳道M，蛋白质分子量标记；泳道1-5：1、2、4、6、8拷贝酵母转化子发酵液上清。4泳道对应的摇瓶表达量可达到350 mg/L左右。(B) 6拷贝酵母转化子的高密度发酵。红色圆点：目的蛋白含量；蓝色方块：菌体湿重。重组蛋白产量即可达到1.26 g/L水平
Q2：蛋白可溶是否等同于其具有正常功能？
传统观念认为“蛋白可溶即折叠正确”，这是一种略显片面的经验性判断，尤其不适用于大肠杆菌生产的重组蛋白。如图2所示，天然蛋白会将疏水基团包裹在蛋白内部，使整个蛋白处于亲水状态，整体表现为可溶；错误折叠的重组蛋白即便未形成正确的空间构象，仍有可能借助自身某些高亲水性的基团或亚基阻止蛋白聚集、蛋白沉淀的发生，从而表现为可溶。显然后者无法与其它蛋白正常发生互作。毕赤酵母是真核宿主，具有完善的蛋白重折叠系统及质量控制系统（二者主要存在于分泌通路上），当重组蛋白发生错误折叠时，内质网中的分子伴侣可与暴露的疏水片段结合，进而将其靶向至重折叠途径或降解途径。基于此酵母细胞保证了每一个分泌到培养基中的蛋白分子都处于正确折叠的状态，进而保证其具有正常的生物活性。该现象可描述为“分泌即可溶，且正确折叠”。
图2 蛋白折叠与可溶性的因果关系示意图
螺旋表示正确折叠的蛋白亚基，曲线表示错误折叠的蛋白亚基。红色表示高度亲水，绿色表示中度亲水，黑色表示疏水。剪刀表示蛋白水解酶。
Q3：糖基化修饰对蛋白互作实验的影响是正面的还是负面的？
糖基化修饰可从多方面影响重组蛋白的结构、功能以及互作情况。首先，糖基化侧链具有较高的亲水性，同时可能“遮蔽”附近疏水性较强的区域，从而提高蛋白溶解度。部分蛋白经去糖基化处理后疏水氨基酸暴露，易发生沉淀。另一方面，糖基侧链可能提供合适的空间位阻，促使二级结构之间保持一定距离，从而形成正确的活性中心或暴露关键位点。最后，毕赤酵母可能发生过糖基化现象。猪瘟病毒E2蛋白（已截短，仅表达N端胞外区）[1]和植酸酶App[2]均含有3个N-糖基化位点，但电泳结果显示蛋白条带偏移量与其N-糖基化位点数目不成线性正相关（见图3）。如果互作位点位于糖基化位点附近，可以想象过长的糖基侧链很可能影响其正常互作。使用Endo Hf（有1分子N-乙酰葡糖胺残留）、PNGase F（无N-乙酰葡糖胺残留）等去糖基化酶处理可去除靶蛋白的糖基侧链，避免干扰实验结果。
图3 酵母过糖基化(A)与正常糖基化(B)的比较
(A)：毕赤酵母分泌表达的猪瘟病毒E2蛋白[1]。泳道1：浓缩纯化后的E2蛋白；泳道2：Endo Hf处理的E2蛋白。黑色箭头：Endo Hf；蓝色箭头：去糖基化的E2蛋白。(B)：毕赤酵母分泌表达的植酸酶App蛋白[2]。泳道1：纯化后的App蛋白；泳道2：PNGase F处理的App蛋白。红色箭头：PNGase F；黄色箭头：去糖基化的App蛋白。
Q4：是否所有蛋白都可在毕赤酵母中实现分泌表达？
一般而言，二硫键配对简单、分子量较小的单体（非聚体）蛋白较易实现分泌表达，其产量也较高。比如犬α干扰素（图4A）的分泌表达产量高于猪瘟病毒E2蛋白（已截短，图4B）。而对膜蛋白而言，单次跨膜和多次跨膜蛋白的表达情况有所不同。首先，单次跨膜蛋白的胞外
区是可以单独进行分泌表达的（图4C）；其次，β折叠桶形状的跨膜通道蛋白无论是否截短都无法分泌表达（即α螺旋比β折叠更适合于分泌表达，图4D）；最后，以α螺旋为主要二级结构的跨膜蛋白有极低可能实现全长的分泌表达（图4E）。简言之膜蛋白截短表达的前提是有像棒棒糖一样“独立”的胞外区。如果没有，目的蛋白就犹如筷子缺了腿，不能进一步形成正确的空间构象，最终被靶向至水解途径而无法分泌。
图4 不同蛋白的空间结构模型
(A)：犬α干扰素；(B)：猪瘟病毒E2蛋白胞外区；(C)：猪瘟病毒E2蛋白全长；(D)：以β折叠为主要二级结构的通道蛋白；(E)：以α螺旋为主要二级结构的膜受体蛋白。
Q5：还有哪些因素可能影响分泌表达？
①基因A/T含量过高有可能导致酵母核糖体在翻译过程中提前脱离mRNA，从而造成翻译终止。如图5A、5B所示，原始LST基因无法在毕赤酵母中实现分泌表达（泳道WT）。通过使用同义密码子，用G/C打断连续的A/T即可改善LST蛋白的表达情况（泳道WT△AT）[3]
。据报道，酵母对密码子偏好并不敏感，但高A/T可能导致表达失败已成为共识。如果直接使用原始基因构建酵母载体，一旦表达失败无法进一步排查原因。通过基因合成构建表达质粒，既有助于提高蛋白产量，又可规避高A/T带来的风险，因此在真核表达实验中被广泛使用。②SpyTag是分子胶水系统的组成部分，有SpyTag001和SpyTag002两个版本[4]。笔者实验证实相同目的蛋白融合SpyTag001后可在毕赤酵母中分泌表达，其融合SpyTag002则不行（图5C）。SpyTag001与SpyTag002相比仅有5个氨基酸不同（图5D），这证明毕赤酵母自身识别了SpyTag002的某段序列并将其错误靶向，从而导致目的蛋白无法分泌表达。鉴于尚未有文献报道可能导致毕赤酵母错误靶向识别序列的细节，可以说任意目的蛋白均有“因错误靶向而无法分泌”的风险。③毕赤酵母分泌表达需要使用酵母信号肽，若目的蛋白本身含有信号肽需将其删除后再插入表达载体。使用SignalP数据库可预测目的蛋白的信号肽序列。该数据库有4.0和5.0两个版本，其预测的信号肽长度可能略有差别。一般信任更长的信号肽预测结果。首先，信号肽切不干净可能影响酵母信号肽发挥功能。其次，过往实验证实如果蛋白N端不参与二硫键形成，其截短3-5个氨基酸一般不会影响功能（成熟犬α干扰素的N端第一个氨基酸为
半胱氨酸，其参与二硫键形成，若截短必然影响活性）。
图5 基因AT含量、特定蛋白序列影响毕赤酵母分泌表达
(A)：不同LST基因的表达结果；(B)：不同LST基因的序列特征；(C)：目的蛋白融合不同SpyTag的表达情况。泳道3、5：Col- SpyTag002、Col-SpyTag001；泳道4、6：P4-SpyTag002、P4-SpyTag001。其中Col和P4为胶原蛋白，二者融合SpyTag001后可以分泌表达，融合SpyTag002后均无法表达。(D)：SpyTag001和SpyTag002的序列比对；
综上所述，毕赤酵母表达系统的优势在于功能性表达的成功率更高，蛋白纯化的难度更低，可优化蛋白产量以满足工业化应用。糖基化修饰可能对蛋白表达有积极作用，通过去糖基化处理亦可避免其对蛋白互作实验的影响。相比大肠杆菌，酵母表达系统更适合于蛋白互作实验所需靶蛋白、候选蛋白的表达。推荐使用毕赤酵母作为科研领域、工业领域的主要表达平台。
参考文献：
[1] D. Li, H. Zhang, L. Yang, J. Chen, Y. Zhang, X. Yu, Q. Zheng, J. Hou, Surface display of classical swine fever virus E2 glycoprotein on gram-positive enhancer matrix (GEM) particles via the SpyTag/SpyCatcher system. Protein expression and purification 167 (2020) 105526.
[2] C. Li, Y. Lin, X. Zheng, N. Pang, X. Liao, X. Liu, Y. Huang, S. Liang, Combined strategies for improving expression of Citrobacter amalonaticus phytase in Pichia pastoris. Bmc Biotechnology 15 (2015) 1-11.
[3] H. Zhao, K. Blazanovic, Y. Choi, C. Bailey-Kellogg, K.E.J.A. Griswold, e. microbiology, Gene and protein sequence optimization for high-level production of fully active and aglycosylated lysostaphin in Pichia pastoris. 80 (2014) 2746.
[4] A.H. Keeble, A. Banerjee, M.P. Ferla, S.C. Reddington, I.N.K. Anuar, M.J.A.C.I.E. Howarth, Evolving accelerated amidation by SpyTag/SpyCatcher to analyze membrane dynamics. 56 (2017) 16521-16525.
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