CRISPRCas9基因敲入试验步骤(三)donor载体构建载体构建

由天下分享时间：2025/1/26 19:05:18 加入收藏我要投稿点赞

CRISPRCas9基因敲入试验步骤（三）donor载体构建载体构建

1、质粒骨架的选择

CRISPR/Cas9质粒按编辑细胞类型可分为八种，

Mammalian 、Bacteria、Drosophila、Plant、C. elegans、 Yeast、Zebrafish、Xenopus,根据质粒所携带的编辑基因的不同，可分为野生型的

cas9、突变型的cas9、cpf1、C2c2

（可剪切RNA ）。当然，还有一些筛选标记，如 puro、GFP、 RFP、mcherry、潮霉素等等，我们可以根据自己的需求选择自己合适的质粒。这里故意还掉了一种，最具有争议的

Ngago,本楼主也重复过这个试验，也和大多数重复的人一样，GFP验证试验时，看到荧光显著减弱（本人还特意构建了一种Ngag。载体，效果比韩老师的效果好很多），但是当时没有验证这个减弱是切割还是敲低，非常遗憾自己想法太简单，以先入为主认为是切割而没有去验证；最终结果是刘东老师使用Ngago发现了有表型（斑马鱼的眼睛上有缺陷），这个就是很强的提示，需要去做下一步，尽管基因组上没有被切割，有表型，那势必会去看该基因表达的数据，最后才有这篇文章。刘东老师运气也很好，knock down有表型，如果没表型，估计也会放弃。这里就说到这，有不懂的可以留言询问。。具体分类在addgene上有，网址

http://www.addgene.org/crispr/ 。 2、酶切位点的选择

插入sgRNA的酶切位点，质粒基本为这两种，BsmbI和Bbsi, 具体可以参见该质粒的 protocol ,后续的连接、转化、验证 protocol里面有，我就不啰嗦了。哦还忘了一件事，使用 snapgene这个软件可以很好地看质粒图谱，非常方便，强烈推荐！！以慢病毒载体 V2为例具体说明3、同源臂的设计同源臂我们一般都是在切割位点的两端各选一段，长度大约 1kb-2kb，效率还可以。当然了，有人也用

做成功了，但基本原则是越长效率越高。

40-100bp做了也 1kb-2kb效率已经

很高，所以这个最合适。有相关文献支持，自己 Pubmed查看。 4、启动子、目的基因及其终止子的扩增这里也没什么可说的，启动子在我们选择质粒的时候就决定了，当然我们还可以改造以提高

sgRNA的表达效率，这个

时候我们可以通过方法筛选出该物种的启动子，替换上去就 ok 了。

目的基因的话，如果我们要做敲除，基本就是根据基因组，在外显子区域设计 sgRNA序列，切割后以非同源性末端接合(Non-homologous end joining, NHEJ ),造成变异而使该基因失去功能。当然还有一种修复方式，同源性重组

(Homologous recombination , HR)同源性重组修复是利用

细胞内的染色体两两对应的特性，若其中一条染色体上的 DNA发生双股断裂，则另一条染色体上对应的

DNA序列即

可当作修复的模版来回复断裂前的序列，因此在某些条件下，同源性重组乂称作基因转换（ gene conversion） o该方法是用于敲入基因，这个同时，我们可以加入抑制

NHEJ修复

的酶，同时就会促进 HR修复，提高重组插入效率。终止子的话，没什么特别，基本可以通用， BGH终止子等。