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翻译自Diagnostics based on nucleic acid sequence variant profiling PCR,hybridization, and
NGS approacheS
基于诊断的核酸序列突变分析方法：PCR、杂交和NGS
摘要
核酸序列的突变与许多疾病相关。对DNA/RNA类生物标记物的可靠检测和定量能够为我们提供有效的治疗方法，使精准医疗成为可能。临床使用的核酸分析技术可大概分为PCR、杂交和NGS这三类以及它们的混合使用方法。本文综述了当前主要商用分析方法的分子机制及其转化为体外诊断的进程。 目录
1. 前言 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .0 2. 聚合酶链式反应 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 2.1. ARMS和相关技术. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .0 2.2. Blocker PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 2.3. 多重PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 2.4. 数字PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .0 3. 杂交 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 3.1. 微阵列 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 3.2. 荧光条码 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 3.3. 原位杂交 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 3.4. 其他读取方式 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 4. NGS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .0 4.1. 主流NGS平台 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 4.1.1. Illumina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .0 4.1.2. Ion Torrent . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 4.2. 其他NGS平台 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 4.2.1. Pacific Biosciences . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... 0 4.2.2. Oxford Nanopore . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . 0
4.2.3. Genia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . .. 0
4.3. 序列富
集 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .0
4.3.1. 杂交捕获 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . 0
4.3.2. AmpliSeq . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0
4.3.3. Droplet-based
enrichment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .0
S. . . . . ..
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4.3.4. Ligation-based enrichment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0
5. 作者观点. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 5.1 合成生物学
5.2 合成生物学促进DNA诊断的开发 6. DNA诊断的未来
能力有限，翻译中有很多错误之处。强烈建议查看原文，以更好的理解作者的意图。 1前言
人体DNA序列的突变非常普遍；一些研究认为，两组不相干的人基因组中，每300个核苷酸中就有一个不同。由于这些突变发生在含子或者是不改变氨基酸序列的无义突变，其中绝大部分对表型只有很小或者没有影响。然而大量的遗传性疾病是由单基因的序列突变引起的，而且突变在肿瘤生长和转移的过程中至关重要。同样，病原体DNA的序列突变也会对人体健康造成不同程度的影响，其中病原体的耐药性已经成为世界围的医疗卫生问题。
许多对序列突变的检测和定量技术被用于疾病和基因组的研究。这些技术可以概括为三类以及这三类的混合使用：聚合酶链式反应（PCR），杂交技术和下一代测序技术（NGS）（图一）。每种技术各有优缺点，本文会对他们进行比较分析。本文写作期间有大量的PCR和杂交分析技术被FDA认证批准作为体外诊断试剂。而NGS仍处于临床应用的初期，仅有illumina 和Ion Torrent 在2014年获得FDA认证。一些公司，特别是基因健康管理公司，通过实验室自建项目（Laboratory developed test，LDTs）而非体外诊断，来提供临床NGS分析服务，但是LDTs最近也被纳入FDA监管围。详情见BOX1对IVDs和LDTs的解释。
S. . . . . ..
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Figure 1 可用于序列突变检测和分析的技术汇总。三类方法：PCR、杂交和NGS。这三类技术会有所重叠，并且许多技术可以联合使用。
BOX1:
美国对于应用于临床的DNA检测的监管规则。
体外诊断（IVDs）。 美国政府定义IVDs：预期用途为疾病诊断或其他条件（健康状态测试，用于疾病的预防、治愈，缓解、治疗）的试剂，仪器和系统。医疗器械被分为一类、二类和三
类。第三类需要最复杂和最严格的监管审查。大部分DNA检测被归为第二类医疗器 械（比如肺结核PCR和囊胞性纤维症NGS） FDA监管商用IVDs产品，对其安全性和有效性进行合理保证。为了能够合法出售IVD
产品，需要提交给FDA一份上市前文件，满足以下要求之一：1）510(k)许可。2)创 新许可 或3）上市前批准。 FDA510(K)许可（FDA cleared）是最容易通过的，但需要向FDA证明，该产品“实质
上等同”于以前通过FDA510(K)许可过的产品，最终都要追溯到1976年以前的产品 或者是FDA新批准的产品。 如果新研制的产品如果没有合适的等同设备存在，那么也能获得许可，但FAD会认
为该产品有低等到中等的风险。 FDA批准（FDA approved）是对第三类IVD产品的最高等级监管。 实验室自建项目（LDTs）。
在某个特定的实验室内一些新的检测项目被建立、评估和验证。这些检测项目叫做 实验室自建项目。这种检测只能在该实验室内使用，不能外传或者出售给其他任何实验室或者医疗保健机构。通常情况下，实验室将选择开发和使用LDT是因为当前
没有商业化试剂盒可用。 联邦政府通过医疗保险和医疗补助服务中心（CMS ）和临床实验室改进修正案S. . . . . .. （CLIA ）很大程度上地管理其开发、评估和实验室自建项目的使用。在美国大约有25万所CLIA实验室，其中绝大多数LDTs相对简单（如血液固醇检测）且没有经过FDA的评估。 .. . .. . .
DNA序列突变检测在疾病的学多阶段都是有用的，每一个阶段有不同的临床价值。详见BOX2，诊断测试的分类汇总。从技术层面来讲，序列突变检测中，应用不同需要的性能水平也会不同。比如生殖细胞常染色体显性突变风险评估中，50%的突变靶标可被稳定检测区分出来。对于用来检测并判断治疗方法的肿瘤活检样本来说，与野生型序列相比可能只包含5%的突变。对于非侵入性筛查和循环应用的外周血来说，DNA测试必须足够特异才能够检测到突变频率为0.1%或更低的等位基因。
临床应用的DNA分析技术的发展必然滞后于科学研究，因为对诊断测试来说，高分析精度是必要但不充分条件。FDA认为IVDs要满足临床所需求的高灵敏度和特异性。BOX3是对这些指标要求的详细说明。
BOX 2：DNA诊断的临床作用
能给为临床决策提供有用信息，是一个有价值的DNA诊断所必须的。因此DNA诊断测 试可依据病人类型和根据检测结果所能得出的相应决策来分类。 1. 风险评估。一部分携带有种系突变的人群（可遗传）罹患某种疾病的风险要高。分 析无明显病症的个体在将来患有某种疾病的可能性即为风险评估。例如Myriad Genetics公司推出的女性乳腺癌风险评估：BRCA1/2测试。 2. 筛查。对一些疾病来说，传统的诊断方法具有侵入性或不方便，因此在没有明确的 疾病症状的情况下会很少使用。分析无明显病症的个体，尽可能在疾病发生的早期 检测出来即为筛查。例如Exact Sciences公司为55岁以上人员提供的筛查结直肠癌 的测试：ColoGuard test 3. 诊断。患者可能出现非特异的疾病迹象（比如：疼痛，低血压），许多疾病都有这S. . . . . .. 些症状。诊断检测能够提供明确的疾病评估。例如：罗氏的SeptiFast 检测。可在6h内直接检测覆盖90%血流感染常见致病菌的25种细菌或真菌。 .. . .. . .
BOX3：性能指标分析 在使用特异性和灵敏度这两个表述DNA分析性能的概念时，会有些许混淆。在实 验室早期的概念验证阶段，一个DNA序列突变检测分析方法的分子灵敏度为：能够准 确的检测出来的目的DNA序列的数量或浓度（例如20拷贝）。分子特异性为：目的突 DNA序列产生的信号高出野生型或其他突变的程度（如：检测到的阳性样本的信号变 值与阴性对照信号值的商）。对NGS来说，分子特异性即为其测序过程的固有错误率。 评估一个检测试剂的分析灵敏度和分析特异性，要有一套阳性和阴性对照样本， 阳性对照样本有突变目的序列，阴性对照样本无突变。这些样本已经被第三方验证过。 分析灵敏度：阳性对照样本中，被评估试剂所能正确的检测出为阳性的样本所占阳性 对照样本总数的比率。 分析特异性：阴性对照样本中，被评估试剂所能正确的检测出为阴性的样本所占阴性 对照样本总数的比率。 一般情况下，一个检测试剂的分析特异性和分析灵敏度要非常接近100%，才能上市成 为诊断试剂。 临床灵敏度和临床特异性要考虑对患者疾病诊断的有效性。临床灵敏度：正确的S. 检测为阳性的病患数占 disease-positive patients . . . （有该疾病） 的比率。临床特异性： . .. 正确的检测为阴性的人数占disease-negative patients（无该疾病） 的比率。由于临床灵敏度和特异性不能用来计算低水平的信息如DNA靶标序列，所以要用其他算法来进
基于诊断的核酸序列突变分析方法：PCR、杂交和NGS
