第五届温州大学生物学科实验技能大赛答案
1.药品配置中应注意哪些问题？请给出应用固体氯化钠粉末配置1L用于细胞生物学实验的生理盐水的方法（包括仪器、药品称量等各个环节）（10分）
注意事项：药品本身的性质（吸水性、氧化性、毒性、酸碱性、挥发性等）对应的取样工具、保护措施；药品选用的纯度级别；天平和量筒的正确使用；各种器具不可混用、取出的药品不能放回、药瓶盖的放置等防止污染的方法；配制后存放的方法及标签（4分） 细胞生物学实验用生理盐水配制：0.9%氯化钠、去离子水(超纯水)；（2分）
在天平上放一张称量纸，去皮，用药勺取NaCl固体，称取9.0 g；在烧杯中用少量去离子水溶解，冷却至室温后，用玻璃棒引流，移入1000 ml容量瓶中；用蒸馏水少量2-3次冲洗烧杯，并将液体倒入容量瓶，向容量瓶中加入蒸馏水至刻度线下1 cm左右，用滴管逐滴加入蒸馏水至刻度线，盖上瓶塞，轻轻倒转容量瓶数次，将溶液混合均匀。（用1000 ml量筒量取1 L去离子水，放入烧杯中，将称好的NaCl倒入烧杯，用玻璃棒搅拌至完全溶解）。将溶液倒入试剂瓶中盖好盖子，写好标签配用。（4分）
2.离心机可分为哪几类？各类离心机有哪些应用？使用离心机需要注意哪些问题？（10分）
分类及应用（6分）：a、制备型（分离生物大分子、细胞器和病毒等）、分析型（测试样品沉降系数、分子量、构象、纯度等）、分析制备型； b、低速离心机（分离大颗粒与溶液、血浆与血清等）、高速（DNA、RNA、各种细胞、无机物溶液、悬浮液及胶体溶液等分离浓缩和提纯）、超速（亚细胞器、病毒、核酸、蛋白质和多糖等）；
c、台式、多管微量式、细胞涂片式、高速冷冻式，大容量低速冷冻式；台式低速自动平衡离心机（a、b、c任一种都对） 注意事项（4分）
1 离心机要放在平坦和结实的地面或实验台上，不允许倾斜；
2 通常离心机都会有登记表，请在使用前确实登记使用者、转头、转速、时间； 3 离心管一定要用天平平衡重量（重量平衡），盖上离心管盖子并旋紧； 4 把平衡好的离心管对称地放入离心陀中（位置平衡），盖上离心陀的盖子，注意有无旋紧； 5 完成离心时，要等待离心机自动停止，不允许用手或其他物件迫使离心机停转，待转头完全静止后，才能打开舱门，请尽快取出离心管，先观察离心管是否完全，以及沉淀的位置，尽速把上清倒出，小心不要把沉淀弄混浊。
3.请问哪些生物实验需要进行高压灭菌（列举三个以上）？常用的高压灭菌条件是什么？如何进行高压灭菌及操作中的注意事项有哪些？（10分）
在微生物实验中，培养微生物所用的器具及培养基、培养液需要预先灭菌，以除去杂菌；被微生物等生物材料污染的玻璃器皿应立即高压灭菌，然后清洗；一些不要的菌种等，一定要消毒和高压灭菌处理后方可弃掉。开展病原微生物类实验所产生的废弃物,在分类处置前,必须先自行高压蒸汽灭菌；发酵实验结束后活菌体必需加热杀死后就能排放；细胞培养和组织培养所用的器具及培养基、培养液需要预先灭菌，以除去杂菌；基因工程操作所用的一切塑料器具（eppendorf管、tip等），在使用前都应装入盒子和瓶子中灭菌，且装盒或装瓶过程中都应采用镊子或戴上一次性手套进行操作，不能直接用手去拿，严防手上杂酶污染。（任何三个都对，3分）
对于一般的试剂、溶液或玻璃器皿等，一般是用121℃高温灭菌20分钟，装液量多的或者含玉米浆的则需30分钟甚至更长时间。而对于葡萄糖、乳糖等则需115℃高温灭菌20-30分钟。温度太高容易变色。（主要是121℃）（2分）
首先，检查锅内蒸馏水量是否充足，第二，检查个个阀门及开关是否工作正常。第三，将待灭菌的物品用一层牛皮纸或两层报纸包好，一定要包完整！放入锅内，物与物之间一定要有空隙。第四，盖好锅盖，螺母对称拧紧，打开放气阀，关闭安全阀。第五，打开电源观察放气阀是否有蒸汽流出，确定后关闭放气阀，待压力表到达0.1-0.15kpa（温度121℃左右）时计时，15-30分钟，关闭开关。第六，待压力表指针归零后，打开放气阀，按对称方式打开锅盖，取出物品。（2分）
注意事项:1.锅内水必须用蒸馏水或纯化水。2.锅盖螺母必须对称拧紧。3.一定要在放气阀出大量蒸汽在关闭。4.当灭菌时间结束时，必须等到压力表归零在打开。5.灭菌锅超过最大耐受压力后，放气阀会自动弹开，此时锅内物品不能保证灭菌完全，需从新灭菌。高压灭菌液体终止时，不能快速排气使压力迅速降低；高压灭菌锅灭菌时，待灭菌的物品不能与含有腐蚀性抑制剂或化学试剂的物质放在一起灭菌；（3分） 4.动物解剖实验中应注意哪些问题？（10分）
实验预习：熟悉动物器官血管位置，了解待观察部位。
实验动物检疫、安抚：防止疾病感染及动物咬伤抓伤
实验器具的使用：防止玻璃器皿、注射器、手术刀的创伤； 实验操作：防止破坏关键部位、实验记录
废弃物：实验动物所产生的粪便、尿液、毛发、皮屑、尸体；实验动物房的污水和污物等，统一回收，做无害处理。
5.实验室常见的安全问题有哪些？（10分）
人员安全：实验服，平底覆盖脚面的鞋，必要时需手套、护目镜和口罩，保持实验室通风，禁止在实验室内吃喝、喧闹
药品安全：按药品性质分类存放，防变质，防污染，有毒、有害、易燃和易爆物质严格管理，禁止药品外带、食用等
仪器安全：严格按照操作规程进行，如离心机配平、灭菌锅和水浴锅放干烧等 水、电、煤气安全：用时开启，用完关闭，注意防火，离开实验室前检查
实验动物：实验动物需专门渠道购买经过检疫，实验过程中防止抓伤等，实验结束后实验材料回收，统一做无害处理
实验菌种、细胞、病毒等：使用时防止人员感染，实验结束后实验材料回收，经灭活后统一处理
6.如何正确的使用显微镜，如何制作洋葱根尖细胞分裂的玻片？（10分）
使用显微镜：取镜和安放：1．右手握住镜臂，左手托住镜座。 2．把显微镜放在实验台上，略偏左（显微镜放在距实验台边缘7厘米左右处）。安装好目镜和物镜。3．转动转换器，使低倍物镜对准通光孔(物镜的前端与载物台要保持2厘米的距离)。 4．把一个较大的光圈对准通光孔。左眼注视目镜内(右眼睁开，便于以后同时画图)。转动反光镜，使光线通过通光孔反射到镜筒内。通过目镜，可以看到白亮的视野。5．把所要观察的玻片标本（也可以用印有“6”字的薄纸片制成）放在载物台上，用压片夹压住，标本要正对通光孔的中心。6．转动粗准焦螺旋，使镜筒缓缓下降，直到物镜接近玻片标本为止（眼睛看着物镜，以免物镜碰到玻片标本）。7．左眼向目镜内看，同时反方向转动粗准焦螺旋，使镜筒缓缓上升，直到看清物像为止。再略微转动细准焦螺旋，使看到的物像更加清晰。
注意事项：实验完毕，把显微镜的外表擦拭干净。转动转换器，把两个物镜偏到两旁，并将镜筒缓缓下降到最低处。最后把显微镜放进镜箱里，送回原处。（5分）
制片：①根的培养洋葱的根用水培养。找一个奶瓶，盛满水，将洋葱底部浸入水中，放在实验室北侧的窗边，室温、自然阳光下，并每日换一次水，3-5日可取根。种子发芽培养时用直径15cm的培养皿，底部铺两层浸湿的吸水纸，放在室温（23°C）的条件下3-5日即可。② 固定解离及染色：a从上午8时开始每隔1h选取一定数量的根放入酒精：兵醋酸=3：1的固定液中，室温下浸泡10min，然后转入70%的酒精溶液中保存待用。b、将固定以后的根转入盛有15%HCl溶液的试管中，再将试管放入盛有60°C-65°C的水溶液中解离约3min。c、将根从解离液中取出，放在载波片上，切取尖端1mm-3mm滴加0。2%的醋酸洋红液1-3滴染色5min。③ 装片的制作：染色以后的根尖之上，盖上盖波片，用拇指垂直轻压盖波片，以使细胞分散开。若要制成永久装片，可用干冰法，取掉盖波片，室温下风干一昼夜。④ 观察先在低倍镜下找到生长点部位，然后换上高倍镜详细观察，并统计细胞分裂数目，计算分裂指数。 分裂指数=（分裂期的细胞数/分裂组织的细胞数）*100%（5分）
7.什么是蛋白质变性和核酸变性，他们的本质分别是什么？引起其变性的因素有哪些？这些变性现象对生物学研究有何意义？（10分）
蛋白质变性：在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。变性的本质:破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。引起蛋白质变性的原因可分为物理和化学因素两类。物理因素可以是加热、加压、脱水、搅拌、振荡、紫外线照射、超声波的作用等；化学因素有强酸、强碱、尿素、重金属盐、十二烷基磺酸钠(SDS)等。
核酸的变性：在物理和化学因素的作用下，维系核酸二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA由双链解旋为单链的过程。引起变性的因素很多，升高温度、过酸、过碱、纯水以及加入变性剂等都能造成核酸变性。
应用：去除有害物质、有害生物、生物产品制备、生物学检测、生物基因改造等
8.请问你对H7N9病毒的生物学特征有何认识，并推测人们获得这些信息的实验手段有哪些？或列举出对一种致病病毒进行研究的方向与方法。（10分）
H7N9型禽流感是一种新亚型流感病毒，基因组为分节段单股负链RNA。依据病毒颗粒外膜血凝素(H)和神经氨酸酶(N)蛋白抗原性不同，命名。所有人类的流感病毒都可以引起禽类流感，但不是所有的禽流感病毒都可以引起人类流感。流感病毒普遍对热敏感，对低温抵抗力较强，65℃加热30分钟或煮沸(100℃)2分钟以上可灭活。病毒在较低温度粪便中可存活1周，在4℃水中可存活1个月，对酸性环境有一定抵抗力，在pH4.0的条件下也具有一定的存活能力。在有甘油存在的情况下可保持活力1年以上。基因来源H7N9禽流感病毒基因来自于东亚地区野鸟和中国上海、浙江、江苏鸡群的基因重配。而病毒自身基因变异可能是H7N9型禽流感病毒感染人并导致高死亡率的原因。（3分） 血清学检验方法的运用。利用抗原捕捉ELISA，筛选和排除可疑病原体；采用双份血清IgG、IgM进行检测，分析抗体产生规律，摸清感染进程
通过体外培养, 细胞病变效应
通过体外培养、滤过性、染色显微镜观察等初步区分细菌或病毒 电镜观察病毒形态
病毒核酸基因的分子生物学及生物信息学鉴定：病毒基因抽提、确定类型；应用已知病毒保守区PCR引物进行PCR扩增，进行病毒的基因组的酶切分析，扩增片段长度多态性，在已有的基因库中进行同源性比对；
RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性内切酶片段长度多态性）DNA提取→用限制性内切酶酶切DNA→用凝胶电泳分开DNA片段→把DNA片段转移到滤膜上→利用放射性标记的探针杂交显示特定的DNA片段（Southern杂交）和结果分析。研究基因型分型和多样性
AFLP（amplified fragment length polymorphism，扩增片段长度多态性）：主要包括模板DNA制备，酶切片段扩增及凝胶电泳分析。研究病毒的分类和进化。 蛋白质组学：纯化病毒后进行一维、二维电泳挖蛋白点测序， 检测试剂盒的研究：基因芯片、ELISA检测试剂盒，（7分）
9.生物工程包含哪几个工程门类？这些方向各自主要研究的是什么？（10分） 生物工程包括四大工程，即遗传工程(基因工程）、细胞工程、微生物工程(发酵工程）、酶工程(生化工程）。（也可以有生物反应器工程）
在这四大领域中，前两者作用是将常规菌（或动植物细胞株）作为特定遗传物质受体，使它们获得外来基因，成为能表达超远缘性状的新物种——“工程菌”或“工程细胞株”。后两者的作用则是这一有巨大潜在价值的新物种创造良好的生长与繁殖条件，进行大规模的培养，以充分发挥其内在潜力，为人们提供巨大的经济效益和社会效益。
遗传工程(基因工程）主要原理是用人工的方法，把生物的遗传物质，通常是脱氧核糖核酸(DNA)分离出来，在体外进行基因切割、连接、重组、转移和表达的技术：基因的转移已经不再限于同一类物种之间，动物、植物和微生物之间都可进行基因转移，改变宿主遗传特性，创造新品种(系)或新的生物材料。
细胞工程是应用细胞生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计蓝图，进行在细胞水平上的遗传操作及进行大规模的细胞和组织培养。当前细胞工程所涉及的主要技术领域有细胞培养、细胞融合、细胞拆合、染色体操作及基因转移等方面。通过细胞工程可以生产有用的生物产品或培养有价值的植株，并可以产生新的物种或品系。
微生物工程(发酵工程）是指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种新技术。发酵工程的内容包括菌种的选育、培养基的配制、灭菌、扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离提纯等方面。
酶工程(生化工程）就是将酶或者微生物细胞，动植物细胞，细胞器等在一定的生物反应装置中，利用酶所具有的生物催化功能，借助工程手段将相应的原料转化成有用物质并应用于社会生活的一门科学技术。它包括酶制剂的制备，酶的固定化，酶的修饰与改造及酶反应器等方面内容。酶工程的应用，主要集中于食品工业，轻工业以及医药工业中。（每个2.5） 10.你是如何理解生物学中的糖类和脂类？（10分）
糖类：多羟基的醛或酮，及其聚合物和某些衍生物，高亲水性化合物。能量直接供体（葡萄糖），机体骨架（纤维素），储能物质（淀粉），遗传物质的骨架（DNA\\RNA），信号传递物质（糖蛋白、糖脂等）(4分)
脂类：由脂肪酸和醇作用生成的酯及其衍生物统称为脂类，这是一类一般不溶于水而溶于脂溶性溶剂的化合物。是能量储存的最佳方式，如动物、油料种子的甘油三酯，在供给人体能量方面起着重要作用；脂类也是人体细胞组织的组成成分，如细胞膜、神经髓鞘都必须有脂类参与；动物的脂肪组织有保温，防机械压力等保护功能，植物的蜡质可以防止水分的蒸发；信号传递、识别和免疫：固醇类激素、糖脂。酶的激活剂：卵磷脂激活β-羟丁酸脱氢酶。糖基载体：合成糖蛋白时，磷酸多萜醇作为羰基的载体。激素、维生素和色素的前体(萜类、固醇类)。生长因子与抗氧化剂。(5分) 糖与脂可相互转化。（1分）
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