抗人宫颈癌单链抗体的表达、结构预测和功能分析
作者：王莹；李旭；陈葳 (西安交通大学第一医院医学实验中心，陕西 西安 710061)
摘要：目的 扩增、表达抗人宫颈癌单链抗体 (ScFv)基因；对ScFv蛋白进行活性鉴定、二级结构、三维结构预测和理化性质分析。方法 采用基因重组技术构建抗人宫颈癌ScFv基因，进行TG1和HB2151两个原核体系的表达；SDS-PAGE、Western blotting、竞争抑制实验、免疫组化反应检测ScFv；用Antheprot 4.3软件、Swiss-model、3dpssm 进行蛋白理化性质分析和立体结构模拟。结果 抗人宫颈癌可溶性ScFv大小为32 000左右，与预计蛋白相对分子质量相符；可溶性和展示性ScFv均可与人宫颈癌细胞株细胞膜表面抗原结合。免疫组化显示能与宫颈癌组织特异性结合而不与正常宫颈组织和其他肿瘤组织结合。ScFv蛋白等电点预测值为7.215，属于α+β蛋白；VH和VL区均有多个蛋白激酶C磷酸化位点和酪氨酸激酶II磷酸化位点。三维结构预测显示linker 贴近，使VL和VH形成一个疏水的“口袋”，这一结构有利于抗原的结合。结论 经基因工程方法制备的抗人宫颈癌ScFv具有与亲本单克隆抗体相似的抗体活性和特异性。抗人宫颈癌ScFv构建为进一步构建双特异性ScFv和双功能ScFv基因创造了条件；其成功的表达为人宫颈癌的早期诊断和特异性治疗打下了基础。计算机对ScFv蛋白的空间结构的模拟和理化性质的分析为ScFv的进一步改建和抗原、抗体反应的研究提供了宝贵的资料。 关键词：宫颈癌；单链抗体；二级结构；三维结构 中图分类号：R737.33 文献标识码：A 文章编号：1673-4254(2006)01-0016-06
Expression, structure prediction and functional analysis of murine single-chain fragment variable antibody against human cervical cancer
WANG Ying；LI Xu；CHEN Wei
Medical Laboratory Center, First Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China
Abstract: Objective To amplify and express the gene encoding murine single-chain fragment variable (scFv) antibody against human cervical cancer and predict the secondary structure and three-dimensional structure of the antibody. Methods The gene fragments coding for the variable region of the heavy and light chains of scFv antibody against human cervical cancer were amplified respectively using recombinant DNA techniques from CsA125 hybridoma cells, and spliced together using a flexible linker to the antibody. The scFv genes were then cloned into the expression vector pCANTAB 5E and expressed in E.coli HB2151 and TG1, respectively. The scFv antibody obtained was assayed using SDS-PAGE, Western blotting, and immunohistochemical analysis, with its secondary structure and three-dimensional structure predicted with Swiss-model and 3dpssm. The physicochemical properties of the antibody were analyzed with Antheprot software. Results The expressed scFv antibody was soluble and phage-displayed. The specific binding capacity of the soluble and phage-displayed scFv antibody to the surface-associated antigen of human cervical cancer cell line were further confirmed. The scFv antibody had a relative molecular mass of 32 000 as was consistent to theoretical prediction, with pI of 7.215 and characterized to
belong to α+β protein. The antibody contained many protein kinase C phosphorylation sites and casein kinase II phosphorylation sites in both the VH and VL domains. Computer graphic modeling indicated that the linker was isolated from the VH and VL domains, which formed a hydrophobic pocket in the molecule to facilitate antigen binding. Conclusions The soluble and phage displayed scFv antibody expressed in E.coli against human cervical cancer shows high and specific affinity to the cervical cancer cell line surface-associated antigen. The construction and analysis of the molecular model of the antibody may facilitate further studies in engineering of the antibody and exploration of the mechanism of the antigen-antibody interaction.
Key words: cervical cancer; single-chain fragment variable antibody; secondary structure; three-dimensional structure
收稿日期：2005-07-12
基金项目：陕西省自然科学基金项目(99SM52)
Supported by Natural Science Foundation of Shaanxi Province (99SM52) 作者简介：王 莹(1971-)，女，在读博士研究生，电话：029-85323528，E-mail: ywang00@163.com
通讯作者：李旭，教授，电话：029-5323528，E-mail: lixu@tom.com
宫颈癌是妇女中最常见的恶性肿瘤之一，近年来，虽然诊断和治疗方法有了飞速的进展，但是如何提高宫颈癌的远期生存率仍是临床和基础研究的重要课题[1]。随着基因工程技术、尤其是噬菌体展示技术的进一步发展[2]，基因工程抗体在疾病诊断和治疗中的研究和应用越来越广泛。我们实验室建立了多株抗人宫颈癌杂交瘤细胞株，其中CsA125杂交瘤细胞株能特异性分泌高亲和性和高特异性的mAb CsAb125，并经动物实验有较好的靶向性。我们以CsA125为原料，应用分子生物学技术构建了抗人宫颈
癌mAb CsAb125的ScFv基因，并进行原核表达和空间结构预测，为宫颈癌的预防、导向诊断和治疗打下了基础。
1 材料与方法
1.1 质粒、细胞来源以及试剂盒
抗人宫颈癌CsA125杂交瘤细胞株、宫颈癌细胞株Cs1213[3]由本室自建。pMD18-T vector购自大连宝生物工程公司；pCANTAB5E表达载体、TG1和HB2151表达体系以及linker全长基因为大连理工大学胡学军博士惠赠。3'-full RACE 试剂盒、5'-Full RACE试剂盒、PCR 片段回收试剂盒均购自大连宝生物工程公司；即用型免疫组织化学超敏S-P试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。 1.2 引物
引物由大连宝生物工程有限公司合成。
1.3 生物学软件
基因比对与分析网站http://www.ncbi. nlm .nih.gov/blast；蛋白综合分析软件Antheprot由http://www.biosoft.com 提供；二级结构预测网站http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/3dpssm/。三级结构预测工作站SWISS-MODEL由GlaxoSmithkline 公司提供。三级结构观察软件为PdbViewer 3.7，MDLChime 和Rasmol软件；截图软件为HyperSnap DX-4.
1.4 ScFv基因的构建及结构分析
1.4.1 VL基因片段的扩增 用3'RACE和5'RACE法进行扩增[4]。ScFv的构建：重叠延伸连接法将VH和VL用一段linker连接起来 [5]。
1.4.2 基因片段测序和同源性分析 分别登陆NCBI BLAST基因和蛋白数据库，进行基因和蛋白的同源性分析。应用蛋白序列分析软件包ANTHEPROT 4.3分析该基因所编码的蛋白氨基酸组成、等电点、疏水性、抗原性等理化性质。应用ANTHEPROT 4.3 和3dpssm分别对编码蛋白进行二级结构预测。SWISS-MODEL 进行蛋白的3D 结构预测。 1.5 ScFv基因与pCANTAB-5E表达载体进行连接和转化 抗人宫颈癌ScFv基因与pCANTAB-5E表达载体进行连接反应，并转化感受态细胞TG1和HB2151菌。 1.6 ScFv基因的表达
IPTG 1 mmol/L，30 ℃进行诱导，培养上清中含可溶性ScFv。可溶性ScFv经硫酸铵初步纯化后进行进一步检测。取重组ScFv基因转化菌TG1，用辅助噬菌体 M13K07进行援救，培养上清含噬菌体展示型ScFv。 1.7 ScFv的鉴定
1.7.1 10% SDS-PAGE和Western blot进行ScFv相对分子质量的鉴定 一抗为ScFv,二抗为鼠抗E-tag抗体，三抗为地高辛标记的羊抗鼠抗体，DAB显色。阴性对照为未经诱导的HB2151。
1.7.2 ScFv的亲和活性检测(竞争结合抑制试验)宫颈癌Cs1213细胞悬液加初步纯化的ScFv封闭抗原后，加亲本mAb CsAb125孵育后，加入FITC标记的兔抗鼠抗体经固定，上流式细胞仪检测。以宫颈癌Cs1213细胞加亲本mAb CsAb125为阳性对照，正常鼠IgG为阴性对照。
1.7.3 ScFv抗原结合活性检测 a:常规制备Cs1213宫颈癌
抗人宫颈癌单链抗体的表达结构预测和功能分析 - 图文
