DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步
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YKK standardization office【 YKK5AB- YKK08- YKK2C- YKK18】
DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤
最近需要做DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,需要用银染显示条带,但是找不到具体的配方和步骤,不知和蛋白PAGE电泳银染有什么差别,哪位师兄师姐有配方可否发一份,十分感谢!一、电泳试剂： 1、30％聚丙烯酰胺(29:1)
丙稀酰胺29克，Bis1克，水100ml。 2、10％过硫酸胺 过硫酸胺1克，水10ml。 3、TEMED 4、5xTBE
Tris 27克，硼酸克， EDTA(pH 10ml，定容至500ml。 二、银染试剂
1、固定液：100ml无水乙醇，5ml冰醋酸，定容至1000ml。 2、% AgNO3：AgNO3 1克，水500ml。 3、% NaOH：NaOH 克，水500ml。 4、37％甲醛。 三、配胶(6%)：
30％聚丙烯酰胺(29:1) 8ml，5xTBE 8ml，定容至40ml，加10％过硫酸胺 200ul；TEMED 20ul。室温凝固时间>1小时。 四、银染：
1、固定液固定10m。 2、水洗2m x3次。
3、% AgNO3 100ml ＋37％甲醛50ul，混匀，避光染色30～50m。 4、水洗 20秒x2次。
5、% NaOH 100ml，加37％甲醛 ，混匀，显色3～10m。 6、水洗若干次，终止显色。
电泳时间：150v x 3h，溴酚兰的位置相当于40bp。 银染后胶面积将膨胀10％。
在终止显色过程中，将依惯性继续显色，所以不等显色到位即可进行终止显色。 显色到位后立即拍摄，水浸泡过夜将使背景加深转贴！！！
聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子生物学常用的一种技术。我们实验室应用该项技术进行基因组甲基化的筛选，取得了一定结果。因为全基因组的筛选需要很高的灵敏度，背景干扰降到最低，因此在对凝胶进行染色时，往往采用同位素法或银染法，而且配制的胶往往很大，我们配制的是大约40×35cm的胶，厚。同位素十分灵敏，特异，但是由于其操作的复杂性，许多实验室开展有一定困难。银染法相对简便易行，便于一般的实验室开展。
需要指出的是，应用与筛选基因组的银染往往采用测序胶的染色方法，这样才能保证灵敏性，我们在长期的工作中积累了一些银染的经验，与大家分享。
下面是网上的一个银染方法，我们使用后觉得效果不错，然后以此为基础，介绍一下我们的经验 测序凝胶的银染
染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。因而至少使用两个盘子，大小与玻璃板类似。在盘中加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。
1. 电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板，凝胶应该牢固地附着在短玻璃板上。
2. 固定凝胶：将凝胶(连玻璃板)放入塑料盘，用固定/停止溶液浸没,充分振荡20分钟或直至样品中染料完全消失，胶可在固定/停止溶液中保存过夜(不振荡)。保留固定/停止溶液，用于终止显影反应。
3. 洗胶：用超纯水振荡洗胶3次，每次2分钟。从水中取出, 当转移至下一溶液时拿着胶板边沿静止10-20秒，使水流尽。
4. 凝胶染色：把凝胶移至染色溶液充分摇动30分钟。 5. 凝胶显影：
DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤审批稿
