9-(E)-红霉素A肟杂质的分离与鉴定
孟祥燕1,2 李娜1 彭凤1 刘瑶1 黄鑫1 沈永淼1,*
【摘 要】摘要：目的 分离、纯化HPLC图谱中紧跟着9-(E)-红霉素A肟的一个未知的杂质，并鉴定它的化学结构。方法 通过柱层析色谱法和重结晶法分离该杂质，然后通过1H-NMR、MS、X-射线单晶衍射确定了该杂质的结构。结果 实验最终确定了该杂质最佳的分离条件：流动相为CHCl3:C2H5OH:NH4OH =10.0:1.2:0.1，重结晶的溶剂为氯仿和丙酮(V:V=7:3)。并用双倍稀释法对红霉素A肟和杂质红霉素E肟进行了抗菌活性研究。结论 未知杂质为红霉素E的E式肟化产物，红霉素E肟的抗菌活性远低于红霉素A肟。
【期刊名称】中国抗生素杂志 【年(卷),期】2016(041)004 【总页数】5
【关键词】红霉素A肟杂质；红霉素E肟；柱层析分离；结构鉴定；抗菌活性 红霉素(EA)是目前最广泛使用的高效抗大多数革兰阳性菌和一些革兰阴性菌的大环内脂类抗生素[1]。由于红霉素在酸性条件下不稳定，红霉素经口服后很容易在胃酸作用下经分子内反应生成无抗菌活性的螺缩酮衍生物，造成生物利用率低[2]。为了提高其稳定性，人们合成了一系列半合成的红霉素衍生物。而9-(E)-红霉素A肟(9-(E)-oxime erythromycin A)则是新一代大环内酯类红霉素衍生物罗红霉素、克拉霉素、阿奇霉素和地红霉素等抗生素的共用中间体(图1)[3]。因此，对此关键中间体的合成从20世纪60年代开始就一直是国际医药界研究的一个热点，红霉素肟的有关物质的研究与分析也受到很多研究人员的
关注[4-7]。姚国伟等课题组已通过高效液相色谱(HPLC)和核磁共振谱(NMR)等手段明确如下有关物质：红霉素肟E、Z异构体，未进行反应的红霉素A(erythromycin A，EA)及其酸性条件下形成的降解产物8,9-脱水-6,9-半缩酮(erythromycin A-6,9-hemiketal，EMAH)、6,9-脱水-9,12-螺缩酮(erythromycin A-6,9-9,12-spiroketal，EMAS)等相关物质[8-11]。
在工业化生产中，红霉素肟的提纯多采用溶解后加水析晶的方式，操作比较简单，质量收率也较好。然而，HPLC对中间体红霉素肟的分析中表明，有一明显杂质峰紧随红霉素肟主峰出现，且对后续产品的影响非常大，如罗红霉素，且这个杂质未有报道。因此，我们对此杂质首先进行了柱层析分离，重结晶。然后通过HPLC-MS、X-射线单晶衍射、1H-NMR谱等方法的研究, 确定了该主要杂质结构。
1 仪器与材料
液相色谱仪(型号：HPLC1200；厂家：安捷伦科技有限公司)，色谱柱(型号：C18；4.6mm×250mm)，核磁共振谱仪(型号：AVANCEⅢ-400M；厂家：瑞士布鲁克拜厄斯宾有限公司)，质谱仪(型号：Thermo LCQ Fleet spectrometer；厂家：美国热电公司)X-射线单晶衍射仪(型号：Brucker SMART APEXII CCD；厂家：瑞士布鲁克拜厄斯宾有限公司)。
硫氰酸红霉素(宜昌东阳光股份有限公司，批号：201405533，含量86.0%)，甲醇钠(江苏森萱医药化工有限公司，批号：20140520，含量29.56%)，氯仿(浙江衢化氟化学有限公司，批号：21411191，含量99.91%)，盐酸羟胺(山东宝源化工股份有限公司，批号：2014052201，含量98.0%)。
2 实验方法
2.1 红霉素c-9肟的合成
室温下，在装有机械搅拌、温度计，冷凝管的500mL三口烧瓶中，投入甲醇150mL，三乙胺60mL，43.56g，0.430mol，硫氰酸红霉素(红霉素A主含量86.5%，水分6.0%)100.0g(0.103mol)，盐酸羟胺31.0g(0.446mol)，冰醋酸10.8mL(11.28g，0.188mol)，pH=6.5～6.9，逐步升温至55℃，继续反应24h结束。反应用HPLC监控，红霉素A含量＜0.5%为反应完全。反应完毕，将反应逐渐降温至20℃，加入260mL纯化水，然后继续降温至5℃，过滤，固体水洗得湿肟盐(9-(E)-红霉素A肟硫氰酸盐)131.8g。
将湿肟盐投入1000mL三口烧瓶中，加入260mL甲醇，加热至25℃，加入30%NaOH溶液，调至pH至11.0左右，再缓慢加入520mL纯化水析晶，加完搅拌12h后离心，固体用水洗涤，得到白色粉末状固体。在65℃左右烘干至恒重，得9-(E)-红霉素A肟79.9g(按水分，含量折算后为0.098mol)，总收率94.15%，m.p. 154.6～158.1℃。 2.2 红霉素c-9肟杂质的柱层析提纯
所用的层析条件如下：固定相：硅胶(200～300目，厂家：烟台江友硅胶开发有限公司)，洗脱剂:体积比CHCl3:C2H5OH:NH4OH =10.0:1.2:0.1。 2.3 色谱条件
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.067mol/L磷酸二氢铵溶液(用三乙胺调节pH值至6.5)-乙腈(65:35)为流动相：检测波长为210nm。取罗红霉素对照品和红霉素标准品适量，加流动相溶解并稀释制成约1mg/mL的混合溶液，取20μL注入液相色谱仪。 2.4 晶体的结晶及测试条件
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