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苏拉明联合人参皂苷Rg3抑制肺腺癌小鼠移植瘤转移的作用

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第２３卷第２１期２０１３年７月中国现代医学杂志ChinaJournalofModernMedicineVol.23No.21Jul.2013（2013）21-0028-07文章编号：1005-8982

·论著·

苏拉明联合人参皂苷Ｒｇ３抑制肺腺癌小鼠移植瘤转移的作用及机制*

贺兼斌，廖慧中，张贻秋，向

志，唐建新

［怀化市第一人民医院（南华大学附属怀化医院）呼吸内科，湖南怀化４１８０００］

本研究旨在观察苏拉明联合人参皂摘要：目的血管生成抑制剂靶向治疗肿瘤已成为目前研究热点之一。

（PG-Rg3）对肺腺癌小鼠异体移植瘤转移的协同抑制作用，并初步探讨苏拉明和PG-Rg3抑制肿瘤转苷Rg3

移的相关机制。方法

复制高转移肺腺癌小鼠移植瘤模型，将40只接种高转移性Lewis肺癌的C57BL/6J小鼠

按随机数字表法随机分成5组：对照组、顺铂组、苏拉明组、PG-Rg3组及苏拉明+PG-Rg3组（联合组）。给予相应药物干预，于接种后24d处死各组小鼠，剥离皮下肿瘤和取出双肺，计算肺转移发生情况，免疫组化和图像分析系统检测皮下移植瘤中组织蛋白酶B（CB）和血管内皮生长因子（VEGF）表达并定量分析，RT-PCR半VEGFmRNA表达。结果定量检测组织蛋白酶BmRNA、

对照组、顺铂组、苏拉明组、PG-Rg3组、联合组的

肺表面转移结节数分别为（14.00±2.90）、（9.77±1.65）、（6.00±1.70）、（5.80±2.02）、（1.93±1.12），CB灰度值分别为（147.24±5.51）、（129.57±5.41）、（87.39±5.03）、（81.38±5.31）、（67.36±4.37），CBmRNA相对量分别为）、（80.45±9.01）、（45.21±7.53）、（39.67±6.84）、（24.33±6.10），VEGF灰度值分别为（156.26±（85.07±9.24

6.45）、（134.7±5.81）、（96.13±5.66）、（90.80±4.92）、（68.73±4.31），VEGFmRNA相对量分别为（91.07±9.43）、（84.45±9.50）、（49.67±8.07）、（45.48±6.46）、（27.39±5.19），苏拉明组和PG-Rg3组中肺表面转移结节数、皮下肿瘤内CB、CBmRNA、VEGF、VEGFmRNA表达与对照组相比明显下降，相反顺铂组对此则无明显影响。联合用药组则显著抑制肿瘤肺表面转移结节数且具有协同作用。结论苏拉明和PG-Rg3对肺腺癌移植瘤的转移具有协同抑制作用，其机制与其抑制肿瘤内CB、CBmRNA、VEGF、VEGFmRNA表达相关。

人参皂苷Rg3；肺腺癌；血管生成抑制剂；肿瘤转移关键词：苏拉明；

中图分类号：R734.2文献标识码：A

InhibitoryeffectsofsuraminincombinationwithPG-Rg3onthemetastasisoflungadencarcinomainmice*

HEJian-bin,LIAOHui-zhong,ZHANGYi-qiu,XIANGZhi,TANGJian-xin

(DepartmentofRespiratoryDiseases,theFirstPeople'sHospital,

Huaihua,Hunan,418000,P.R.China)

Abstract:【Objective】Theschemeoftumortherapythroughangiogenesisbecomesoneofstudyinghotspotsatpresent.TheexperimentisdesignedtoobservethatifsuramincombinationwithSPG-Rg3hassynergeticeffectsofsuppressinglungadenocarcinoma'smetastasisandtostudytherelatedmechanismofsuraminandPG-Rg3'ssup－pressingtumormetastasis.【Methods】FortyC57BL/6JmicebearinghighmetastaticLewiscellswererandomizedin－tofivegroups:controlgroup;DDPgroup;suramingroup;PG-Rg3group;combinationgroup.Eachgrouptobetheappropriateintervention,allthemicewassacrificedbytumorinoculationin24days,Lungandsubcutaneoustumorsweredressedforhistologicalexamination.Themetastatictumorfocionlungsurfaceinmicewereobserved.Lungmetastaticoccurringrateandmetastaticfociinhibitoryratewerecounted.CBandVEGFweredeterminedbyim－munohistochemistrymethodwithimageanalyzesystem,anddetectionofPGPmRNA,MRP1mRNAexpressionby

收稿日期：２０１２－０７－０３

*基金项目：湖南省卫生厅科研基金资助（Ｎｏ：Ｂ２０１０－１３３）

·28·

第２１期贺兼斌，等：苏拉明联合人参皂苷Ｒｇ３抑制肺腺癌小鼠移植瘤转移的作用及机制

RT-PCR.【Results】Controlgroup,cisplatingroup,suramingroup,SPG-Rg3group,combinedgroupoflungmetastaticnoduleswere(14.00±2.90),(9.77±1.65),(6.00±1.70),(5.80±2.02),(1.93±1.12),thegreyofCBwere(147.24±5.51),(129.57±5.41),(87.39±5.03),(81.38±5.31),(67.36±4.37),therelativeamountofCBmRNArespec－tivelywere(85.07±9.24),(80.45±9.01),(45.21±7.53),(39.67±6.84),(24.33±6.10),thegreyofVEGFwere(156.26±

6.45),(134.7±5.81),(96.13±5.66),(90.80±4.92),(68.73±4.31),therelativeamountofVEGFmRNAwere(91.07±9.43),(84.45±9.50),(49.67±8.07),(45.48±6.46),(27.39±5.19).IntheSuramingroupandPG-Rg3group,thenumberoflungmetastaticnodules,theexpressionofCB,CBmRNA,VEGF,VEGFmRNAinsubcutaneoustumorwassignifi－cantlydecreasedcomparedwiththecontrolgroup,contrarytothis,cisplatingrouphadnosignificanteffect.Combi－nationgroupwassignificantlyinhibitedonlungmetastaticnodulesoftumor,ithasasynergisticeffect.【Conclu－sions】SuramincombinationwithPG-Rg3canproduceasynergeticinhibitoryactivityagainstlungmetastasisoflungadenocarcinoma.ThefactthatsuraminandPG-Rg3inhibitedlungmetastasisoflungadenocarcinomamaybeassoci－ateditseffectofsuppressingtheexpressionofCB,CBmRNA,VEGF,VEGFmRNAintumortissue.Keywords:suramin;PG-Rg3;lungadenocarcinoma;angiogenesis;metastasis

在２０世纪５０年代，肺癌的组织学亚型主要是鳞癌，腺癌约仅占５％，但近５０年来，肺腺癌的发病率在迅速上升，２０００￣２００３年，腺癌已占全部肺癌病例的４７％［１－２］。肺腺癌倾向于管外生长，也可循泡壁蔓延，癌瘤内血管丰富，生长快，局部侵润和血行转移发生较早，预后极差，是预后最差的恶性肿瘤之一。转移是恶性肿瘤的重要特征，也是主要死亡原因，因此，发现与肿瘤转移相关的指标已成为国内外学者研究的热点，开发抑制肿瘤转移的药物已成为一项重要课题。苏拉明是一种合成的六萘酸脲阴离子化合物，研究［３］表明它对肺腺癌有明显的抑制作用，人参皂苷Ｒｇ３（ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅＲｇ３，ＰＧ－Ｒｇ３）系由西洋参中提取的单体皂苷，近年来其抗肿瘤作用逐渐

该研究复制肺腺癌细胞高转移小鼠移受到瞩目［４－５］，

植瘤模型，以ＤＤＰ为对照，观察苏拉明联合ＰＧ－Ｒｇ３对肺腺癌移植瘤转移的影响，通过检测移植瘤内组织蛋白酶（ｃａｔｈｅｐｓｉｎＢ，ＣＢ）和血管内皮生长因子（ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）的表达及移植瘤内ＭＶＤ以探讨其抗瘤转移机制。

抗鼠ＣＢ单克隆抗体购自美国ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司，兔

抗鼠ＶＥＧＦ多克隆抗体购于美国Ｄａｋｏ公司，ＣＤ３４广谱型ＳＰ试剂盒、ＤＡＢ显色剂均购自免抗鼠一抗、

福州迈新生物工程公司，ＭＭＬＶ第１链ｃＤＮＡ合成试剂盒，即用ＰＣＲ扩增试剂盒，购于上海生工生物工程技术有限公司。

１．２动物模型的建立

处死两只荷瘤种鼠（接种Ｌｅｗｉｓ肺癌（鼠源）细胞），无菌条件下剥离皮下瘤体，剪去瘤体表面的血管、结缔组织以及内部坏死组织，生理盐水冲洗，剪碎后放入匀浆器，研磨瘤组织成为细胞悬液，滴加生各小鼠右腋下接理盐水调节细胞密度至１×１０７／ｍＬ，

种０．２ｍＬ细胞悬液（含细胞数目２×１０６个）形成小鼠高转移性动物肿瘤模型。１．３分组及用药

４０只实验小鼠皮下移植处均成瘤，接种后第４天开始药物干预。将４０只Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠随机分为五组：荷瘤对照组、顺铂组、苏拉明组、ＰＧ－Ｒｇ３组和联合组。每组８只，雌雄各半。对照组，生理盐水０．２ｍＬ／只腹腔注射（ｉｐ），每天１次；顺铂组，顺铂４ｍｇ／ｋｇ／ｄ溶于生理盐水０．２ｍＬ中ｉｐ，于接种后第４，１１，１８天各１次，并予生理盐水０．２ｍＬ／只每天腹腔注射１次；苏拉明组，苏拉明１０ｍｇ／ｋｇ·ｄ溶于生理盐水０．２ｍＬ中ｉｐ，每天１次；ＰＧ－Ｒｇ３组，ＰＧ－Ｒｇ３１０ｍｇ／ｋｇ／ｄ溶于生理盐水０．２ｍＬ中ｉｐ，每天１次；苏拉明＋ＰＧ－Ｒｇ３组，苏拉明及ＰＧ－Ｒｇ３按以上组用药。肿瘤接种２４ｄ处死全部小鼠，剖胸观察双肺表面肿瘤转移情况，计数肺部表面转移结节数，称肺湿重。肺及皮下肿瘤置入４％的中性甲醛固定，石蜡包）行ＨＥ染色及免疫组化染色，埋，组织切片（４μｍ

１材料和方法

１．１实验动物、细胞株、药品及试剂

Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠４０只，雌雄各半，体质量（２０±２）ｇ，购自中国医学科学院肿瘤医院实验动物中心，许可证号：ＳＣＸＫ１１－００－０００５，由南华大学肿瘤研究所提供ＳＰＦ级饲养环境。Ｌｅｗｉｓ肺癌（鼠源）由中国医学科学院基础医学研究所细胞中心提供，顺铂购于江苏豪森药业股份有限公司（生产批号：０４０６０５），苏拉明购于美国Ｓｉｇｍａ公司，人参皂苷Ｒｇ３纯品，由吉林亚泰制药有限公司提供（生产批号：２０００５３），兔

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中国现代医学杂志第２３卷

切取部分皮下肿瘤迅速放入－１９６℃液氮中保存，用于提取总ＲＮＡ。１．４观察指标及方法1.4.1肿瘤转移的观察

实验结束后，剖胸观察双

（ＣＤ３４抗原，ｈｕｍａｎｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌａｎｔｉｇｅｎ）染色，微血管密度（ｍｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌｄｅｎｓｉｔｙ，微血管或ＭＶＤ）的判定标准，凡与临近的肿瘤细胞、

结缔组织分开的，呈棕黄色ＣＤ３４染色的单个内皮细胞或内皮细胞串计为一个血管，但肌层较厚，或管腔直径大于８个红细胞直径的血管不计数。ＭＶＤ计数参考ＷＥＩＤＮＥＲ等［６］方法，先在低倍镜下扫视整个组织切片，在肿瘤浸润区选择内皮细胞染色清晰，背景良好，微血管最密集的４个视野里，然后在高倍镜视野范围内计数所有染色的微血管，取４个视野的计数结果均数为该切片的微血管数。１．５统计学处理

根据数据类型分别使用组间ｔ检验，χ２检验和相关分析，用ＳＰＳＳ１７．０软件进行统计学处理，以Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１为差异有显著性。

肺表面肿瘤转移情况，计数肺部表面转移结节数，计算肺表面结节转移抑制率：转移抑制率／％＝（１－用药组平均转移结节数／对照组平均转移结节数）×１００％。

1.4.2免疫组化肿瘤标本免疫组化染色检测组织蛋白酶Ｂ和ＶＥＧＦ的表达。采用免疫组化ＳＰ法检测，方法步骤严格按试剂盒说明书进行（一抗１∶１００稀释为工作液），用ＰＢＳ缓冲液代替一抗作阴性对照。组织蛋白酶Ｂ和ＶＥＧＦ的判定标准：高倍镜下计数１００个细胞，肿瘤细胞浆及胞膜中呈棕黄色阳性细胞＜１０％为阴性，≥１０％阳性，采用全自动图像分析系统测定肿瘤组织中组织蛋白酶Ｂ和ＶＥＧＦ的平均灰度值。1.4.3RT-PCR半定量检测组织蛋白酶BmR-NA、VEGFmRNA表达从ＧｅｎＢａｎｋ查取组织蛋白酶ＢｍＲＮＡ序列，以Ｐｒｉｍｅｒ５软件设计引物，组织蛋白酶Ｂ：５＇－ＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＴＧＴＧＧＣＡＣＴＧ－３＇，５＇－ＧＴＴＣＧＧＴＣＡＧＡＡＡＴＧＧＣＴＴＣ－３＇，产物片段大小１９８ｂｐ；内参照ＧＡＰＤＨ：５＇－ＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴ－３＇，５＇－ＧＴＣＴＧＧＧＡＴＧＧＡＡＡＴＴＧＴＧＡ－３＇，产物片段大小６６０ｂｐ，上述引物均由上海生工生物技术服务有限公司合成。采用ＴＲＩｚｏ１法提取肺组织总ＲＮＡ，按两步法ＲＴ－ＰＣＲ试剂盒操作说明逆转录ｃＤＮＡ，并进行ＰＣＲ扩增，ＰＣＲ的反应时序为：①９４℃预变性２ｍｉｎ；②９６℃，１５ｓ；③６２℃，２０ｓ；④７０℃，６０ｓ；共３５个循环后７２℃延伸５ｍｉｎ延伸，ＶＥＧＦ引物：５＇－ＡＧＡＣＡＡＴＧＧＧＡＴＧＡＡＡＧＧ－３＇，５＇－ＡＧＡＴＧＡＧＧＡＡＧＧＧＴＡＡＧＣ－３＇，产物片段大小５５４ｂｐ；内参照ＧＡＰＤＨ：５＇－ＣＣＣＡＴＣＴＡＣＧＡＧＧＧＣＴＡＴ－３＇，５＇－ＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣＣ－３＇，产物片段大小１４５ｂｐ，ＰＣＲ的反应时序为：①９４℃预变性２ｍｉｎ；②９４℃，３０ｓ；③５５℃，３０ｓ；④７０℃，６０ｓ；共３５个循环后７２℃延伸５ｍｉｎ延伸，ＰＣＲ产物经２０ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察扩增条带结果，以Ｍａｒｋｅｒ（上海鼎国生物公司）作为标准相对分子质量参照进行产物鉴定。用Ｔｏｔａｌｌａｂ分析软件进行条带扫描分析，测量电泳条带密度，计

２结果

２．１肺转移情况

肺表面转移结节数：各用药组均明显低于对照组，有显著性差异，联合用药组转移结节数也明显低

），说明联合于单用苏拉明组或ＰＧ－Ｒｇ３组（Ｐ＜０．０１

用药能起协同抑制作用；小鼠肺表面转移结节发生率：苏拉明组、ＰＧ－Ｒｇ３组和联合用药组８只小鼠中分别有６只、６只和５只发生转移，均低于对照组和ＤＤＰ组（８只全部转移），联合用药组与对照组相比具有显著性差异（Ｐ＜０．０５）；转移抑制率的比较：联合组与其它各组比较转移抑制率明显升高，有显著性差异（Ｐ＜０．０１）；肺湿重比较随转移结节数减少而降低，联合组与其它各组比较有显著性差异（Ｐ＜０．０５），见表１，肺表面转移结节见图１。

表１各组小鼠肺转移情况的比较（x±ｓ）

组别对照组顺铂组苏拉明组ＰＧ－Ｒｇ３组联合组

ｎ８８８８８

转移率转移结节数８／８８／８６／８６／８

）

５／８１

转移抑制率／％０．００３０．２５５７．１５５８．５７８６．２１

肺湿重／ｍｇ２３６．３２±１７．５８

）

２０３．７５±２１．４２１）

１７１．８１±１４．４６２）

１６９．２３±１６．２０２）