基于ITS2序列的建泽泻及其混伪品鉴定研究
耿超1，谷巍1，2*，吴启南1，巢建国1，孙红梅1，蒋玲1，韩赟1 【摘 要】摘要：目的 利用ITS2条形码鉴别建泽泻及其混伪品。方法 提取28份建泽泻及其混伪品基因组DNA，PCR扩增ITS2序列并进行双向测序，测序结果提交至GenBank，同时从GenBank下载泽泻科植物及其混伪品10种17条ITS2序列，对提交与下载的45条序列，应用MEGA 5.1软件进行序列比对，计算种内和种间距离，采用相似性搜索法、最近距离法进行鉴定分析，并构建NJ系统进化树直观反映鉴定结果。结果 建泽泻、川泽泻ITS2序列长度均为311 bp，存在1个变异位点；建泽泻与泽泻科泽泻属物种距离较近，与泽泻科其他属及其混伪品之间遗传距离较远；NJ树结果显示建泽泻及其混伪品均可明显区分，表现出良好的单系性。结论 ITS2序列作为DNA条形码可以准确快捷地鉴别建泽泻及其混伪品，为其种质资源鉴定及临床安全用药提供了新的技术手段。
【期刊名称】南京中医药大学学报 【年(卷),期】2016(032)002 【总页数】5
【关键词】建泽泻；混伪品；ITS2；鉴定
泽泻(Alismatis Rhizoma)主产于福建、四川和江西等省，素有“建泽泻”“川泽泻”“江泽泻”之称，建泽泻与江泽泻原植物都是东方泽泻Alisma orientale (Sam.) Juzep.，川泽泻原植物是泽泻A.plantago-aquatica Linn[1-2]，药典收载的泽泻为泽泻科(Alismataceae)植物东方泽泻(A. orientale (Sam.) Juzep.)的干燥块茎[3]。泽泻具有利水渗湿、泄热通淋和
降血脂等功效，主治小便不利、热淋涩痛、水肿胀满、泄泻、淋证、遗精等症。近年来，国内外越来越多有关泽泻的药理研究显示，泽泻具有多种生物活性，包括利尿、降血脂、保肝、降血糖、抗炎、抗肿瘤[4-5]。建泽泻以个大、形圆而光滑、色黄白、质坚实及独特的疗效而驰名中外，历史悠久，是福建省在国内外享有盛誉的地道药材之一。《神农本草经》将其列为上品，《本草纲目》将其列为正品，但市场上出现了同属其他植物的干燥块茎作为泽泻药用[6]，如窄叶泽泻(A. canaliculatum)、草泽泻(A. gramineum)、小泽泻(A. nanum)等。此外，还有一些泽泻伪品，如泽泻科植物慈姑、天南星科(Araceae)植物芋、旋花科(Convolvulaceae)植物甘薯和黑三棱科(Sparganiaceae)植物黑三棱，虽然原植物差别较大，但被加工后外形与泽泻非常相似，利用传统鉴别方法难以准确地将建泽泻及其混伪品区分，在实际使用中容易混淆，造成泽泻药材质量不稳定，难以保证临床用药的安全、稳定和有效。
DNA条形码(DNA barcoding)技术是新兴的物种鉴定方法，是指用短的、标准的DNA片段作为物种标记而建立的一种新的生物鉴定方法，因其操作便捷、技术统一，近年来已逐渐成为生物分类和鉴定的研究热点[7-8]，ITS2的鉴定能力在药用植物多个科属基原植物及药材的鉴定中得到了验证[9-12]，但建泽泻及其混伪品的DNA条形码鉴定研究，目前国内外尚未见报道。本文采用ITS2序列对建泽泻及其混伪品进行分子鉴定，为泽泻的快速准确鉴定、临床安全用药及其开发利用提供科学依据。
1 材料
在福建建瓯采集东方泽泻Alisma orientale (Sam.) Juzep.样品5份，在四川彭山采集泽泻Alisma plantago-aquatica Linn样品5份，在江苏南京、苏州、
扬州、南通等地收集泽泻混伪品慈姑Sagittaria trifolia Linn.样品4份、甘薯Ipomoea batatas (Linn.) Lam.
样
品样品
46
份
、
芋
Colocasia esculenta (L). Schott, Melet份、黑三棱
Sparganium stoloniferum Buch.-Ham样品4份，样品共28份均经南京中医药大学药学院谷巍教授鉴定，凭证样本和数字影像信息保存于南京中医药大学药学院标本馆，实验材料信息及GenBank登录号见表1。同时我们在GenBank数据库下载建泽泻及其混伪品10种17条ITS2序列，信息见表1。
2 方法
2.1 DNA提取、PCR扩增及测序
将样品表面使用70%乙醇擦洗，取建泽泻及其混伪品材料0.01 g，采用植物基因组DNA提取试剂盒(Tiangen Biotech Co., China)提取总DNA。正向引物ITS2F：5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT，反向引物
ITS3R：5’-
GACGCTTCTCCAGACTACAAT。PCR反应体积50.0 μL，体系包含MgCl24.0 μL(25 mmol/L)，dNTP 4.0 μL(2.5 mmol/L)，PCR缓冲液5.0 μL(10×)，引物各2.0 μL(2.5 μmol/L，Generay Co., China)，rTaq酶0.25 μL，总DNA 5.0 μL(约50 ng)。扩增程序：94 ℃变性5 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s(进行40个循环)；72 ℃延伸10 min。测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。 2.2 数据处理
测序后所得峰图采用Codon Code Aligner V2.06(CodonCode Co., USA)校对拼接，去除低质量序列及引物区；使用基于隐马尔可夫模型的HMM注释方法，去除拼接得到的一致序列的两端5.8S和28S区段，获得标准ITS2间隔区
基于 ITS2序列的建泽泻及其混伪品鉴定研究
