萜类化合物极性较大，不易被石油醚展开，但可被石油醚与醋酸乙酯的混合溶剂较好的展开。为了使挥发油中各成分能在一块薄层色谱板上进行分离，常采用单向二次色谱法展开。
【实验仪器与试剂】
1.100、10ml烧杯，250ml三角烧瓶，10ml试管，试管架，托盘天平，量筒，洗瓶，蒸馏装置，电热套，10×20cm薄层板，10×20cm薄层色谱缸，点样毛细管，紫外灯（仪），玻棒，牛骨匙，显色剂喷瓶，小型空压机。
2.八角茴香粗粉，滤纸，三氯化铁试剂，2,4-二硝基苯肼试剂，碱性高锰酸钾试剂，香草醛-浓硫酸试剂（临时配用），0.05%溴酚蓝试剂，硝酸铈铵试剂，柠檬油，丁香油，薄荷油，樟脑油，桉叶油，松节油，丙酮，石油醚（30～60℃），醋酸乙酯。
【实验步骤】 1.茴香脑的提取分离
取八角茴香粗粉50g，置圆底烧瓶中，加适量水浸泡湿润，按一般水蒸气蒸馏法进行蒸馏提取。也可将捣碎的八角茴香置于挥发油测定器的烧瓶中，加蒸馏水500ml与数粒玻璃珠，连接挥发油测定器与回流冷凝管，自冷凝管上端加水使充满挥发油测定器的刻度部分，并使溢流入烧瓶时为止。缓缓加热至沸，至测定器中油量不再增加，停止加热，放冷，分取油层。将所得的八角茴香油置冰箱中冷却1小时，即有白色结晶析出，趁冷滤过，用滤纸压干。结晶为茴香脑，滤液为析出茴香脑后的八角茴香油。
2.检识
（1）油斑试验 取八角茴香油适量，滴于滤纸片上，常温下（或加热烘烤），观察油斑是否消失。
（2）薄层色谱板点滴反应 取硅胶G薄层色谱板1块，用铅笔按表画线。将挥发油试样用5～10倍量乙醇稀释后，用毛细管分别滴加于每排小方格中，再将各种检识试剂用滴管分别滴于各挥发油试样斑点上，观察颜色变化。初步推测每种挥发油中可能含有化学成分的类型。
实-表1 挥发油薄层板点滴反应 试剂 试样 八角茴香油 柠檬油 丁香油 薄荷油 樟脑油 桉叶油 松节油 空白对照
1 2 3 4 5 6 试剂 1．三氯化铁试剂 2．2,4-二硝基苯肼试剂 3．碱性高锰酸钾试剂 4．香草醛-浓硫酸试剂 5．0.05％溴酚蓝试剂 6．硝酸铈铵试剂
（3）挥发油薄层色谱单向二次展开检识 取硅胶H-CMC-Na薄层板（6cm×15cm）一块，在距底边1.5cm及8cm处分别用铅笔画起始线和中线。将八角茴香油溶于丙酮，用毛细管点于起始线上呈一长条形，先用石油醚（30～60℃）-醋酸乙酯（85∶15）为展开剂展开至薄层板中线处取出，挥去展开剂，再放入石油醚（30～60℃）中展开至接近薄层板顶端时取出，挥去展开剂后，分别用下列几种显色剂喷雾显色。
①1％香草醛-硫酸试剂：可与挥发油产生紫色、红色等。 ②荧光素-溴试剂：如产生黄色斑点，表明含有不饱和化合物。 ③2,4-二硝基苯肼试剂：如产生黄色斑点，表明含有醛或酮类化合物。 ④0.05％溴甲酚绿乙醇试剂：如产生黄色斑点，表明含有酸性化合物。
观察斑点的数量、位置及颜色，推测每种挥发油中可能含有化学成分的种类及数量。
【基本操作注意事项】
1.通过观察馏出液的混浊程度来判断挥发油是否提取完全。最初的馏出液中含油量较多，明显混浊，随着馏出液中油量的减少，混浊度也随着降低，至馏出液变为澄清甚至无挥发油气味时，停止蒸馏。
2.提取完毕，须放冷，待油水完全分层后，再将油层放出，尽量不带出水分。 3.进行单向二次展开时，先用极性较大的展开剂展开至中线，然后再用极性较小的展开剂展开。在第一次展开后，应将展开剂完全挥干，再进行第二次展开，否则将影响第二次展开剂的极性，从而影响分离效果。
4.挥发油易挥发逸失，因此进行色谱检识时，操作应迅速及时，不宜久放。 5.喷洒香草醛-浓硫酸显色剂时，应于通风橱内进行；用溴甲酚绿试剂显色时，应避免在酸性条件下进行。
【思考题】
1.从八角茴香中提取分离茴香脑的原理是什么？ 2.利用点滴反应检识挥发油的组成优点是什么？
3.单向二次展开薄层色谱法检识挥发油中各成分时，为什么第一次展开所用的展开剂极性最好大于第二次展开所用的展开剂的极性？单向二次展开薄层色谱法有什么优点？
实验五 黄柏中小檗碱的提取、分离和鉴别
【实验目的】
1.掌握从黄柏中提取小檗碱的原理和方法。 2.掌握小檗碱的理化性质和鉴别方法
3.熟TLC的基本操作以及在中药有效成分提取分离中的应用。
【实验原理】
OON+1.小檗碱(berberine)，含量为1.4%-4%(川黄柏含量较高) 性状：黄色结晶，有5.5个结晶水，mp145℃。
OMeOMe溶解性：能缓缓溶于冷水中（1:20），微溶于冷乙醇（1:100），易溶于热水和熱乙醇，微溶或不溶于苯、氯仿和丙酮，硝酸盐极难溶于水，盐酸盐微溶于冷水（1:500）但较易溶于沸水，硫酸盐和枸橼酸盐在水中溶解度较大（1:30），盐酸小檗碱为黄色结晶，含2分子结晶水，220℃时分解并转变为棕红色小檗红碱，285℃时完全熔融。
2.小檗碱为季铵碱，其游离型在水中溶解度较大，其盐酸盐在水中溶解度较小。利用小檗碱的溶解性及黄柏中含黏液质的特点，首先用石灰乳沉淀黏液质，用碱水提出小檗碱，再加盐酸使其转化为盐酸小檗碱沉淀析出。
【实验仪器与试剂】
1.1000、500、100、10ml烧杯，10ml试管，试管架，托盘天平，量筒，三角漏斗，洗瓶，布氏漏斗，电炉，10×20cm薄层板，10×20cm薄层色谱缸，点样毛细管，紫外灯（仪），玻棒，牛骨匙，纱布，脱脂棉。
2.川黄柏粗粉，滤纸，pH试纸，生石灰，1%硫酸，浓硫酸，浓盐酸，浓硝酸，次氯酸钠，10%氢氧化钠，丙酮，乙醇，稀硫酸，锌粒，食盐，薄层用硅胶H，0.2%CMC-Na，展开剂：苯－乙酸乙酯－异丙醇－甲醇－水（6:3:1.5:1.5:0.3），甲醇，氨水，盐酸小檗碱对照品。
【实验步骤】
1.提取 称取黄柏粗粉200g，加入1%硫酸600mL，搅拌均匀，浸泡过夜，纱布过滤。或称取黄柏粗粉200g，加入1%硫酸200mL，搅拌均匀，使湿润度合适，放置30min后，装入渗漉筒内，用1%硫酸浸泡过夜，渗漉，速度以5～6mL/min为宜。收集渗漉液500～600mL即可停止渗漉。
2.取上项提取液，加入石灰乳调pH11～12,静置沉淀，脱脂棉滤过，滤液用浓盐酸调pH2～3，再加入溶液量10%食盐，搅拌使溶解，溶液静置过夜，析晶，滤取结晶，得盐酸小檗碱粗品。
3.精制 将盐酸小檗碱粗品放入25倍量沸水中，于水浴上加热使溶解，趁热滤过，滤液加浓HCI调pH2左右，静置过夜，滤取结晶，80℃以下干燥，得精制盐酸小檗碱。
4.盐酸小檗碱的鉴别
（1）取盐酸小檗碱少许，加漂白粉（或次氯酸钠）少许，即显樱红色。
（2）取盐酸小檗碱少许，加稀硫酸2mL使溶解，加浓硝酸1～2滴，即显樱红色。 （3）取盐酸小檗碱约0.05g，溶于5mL热水中，加入10%NaOH溶液2mL，显橙色。溶液放冷，加入丙酮约0.5mL，放置，有黄色丙酮小檗碱结晶析出。
（4）取盐酸小檗碱少许，加水2mL溶解后，加锌粉少许，再分数次加入浓硫酸数滴，振摇，每隔10min加一次，观察其黄色是否消退。
（5）薄层色谱鉴别
吸附剂：硅胶H-CMC-Na板。
展开剂：苯－乙酸乙酯－异丙醇－甲醇－水（6:3:1.5:1.5:0.3），氨蒸气预平衡10min后展开。
样品液：自制盐酸小檗碱甲醇液（每1mL含0.5mg）。 对照品液：盐酸小檗碱对照品甲醇液（每1mL含0.5mg）。 显色：置紫外灯（365nm）下检视，显黄色荧光斑点。 结果：记录样品斑点和对照品斑点的颜色和位置，计算Rf值。
【基本操作注意事项】
1.实验原料尽可能选用小檗碱含量较高的川黄柏，或小檗碱含量较低的关黄柏，后者粘液质较多过滤麻烦。
2.加入氯化钠的目的是将小檗碱转化成盐酸小檗碱并利用其盐析作用，降低其在水中的溶解度。其用量不宜过少，否则盐析效果不好，收率过低。
3.在精制盐酸小檗碱时，因为盐酸小檗碱几乎不溶于冷水，放冷易析出结晶，所以水浴加热溶解后，要趁热滤过，防止盐酸小檗碱在滤过时析出结晶，使滤过困难，产量降低。
【思考题】
1.怎样从黄柏中提取分离盐酸小檗碱？原理是什么？为什么加石灰乳？
2.通过从黄柏中提取盐酸小檗碱，试述药材粉碎度等对提取的影响。
3.用薄层色谱法检识盐酸小檗碱时，选用氧化铝或硅胶作吸附剂，二者有何区别？展开剂有何不同？
实验六 茶叶中咖啡因的提取
一、实验目的
1、学会从天然产物中提取有机粗产物的方法 2、学习和掌握常压升华纯化技术
二、实验原理
茶叶中含有多种生物碱，其中以咖啡碱（咖啡因）为主，占1.5％，另外还含有11－12％的丹宁酸（鞣酸），以及色素、纤维素、蛋白质等。
咖啡因（含结晶水时）是无色针状结晶，味苦，能溶与水（2％）、乙醇（2％）、氯仿（12％）、苯（1％）等。
咖啡因在100℃时即失去结晶水，并开始升华，120℃时升华显著，178℃时升华很快，熔点为234.5℃；呈弱碱性。
茶叶中咖啡因的提取可采用溶剂提取法得到咖啡因初产品。 粗产物的纯化可采用升华法。
三、实验仪器和试剂
1、材料和试剂：茶叶粗粉、95%乙醇、氧化钙、
2、仪器：坩埚、漏斗、超声波清洗机、150mL烧瓶、250mL三角瓶、电炉子
四、实验方法与步骤
1、取茶叶粗粉50g，加适量95%乙醇浸泡24h，超声提取30min，过滤得提取液，将提取液减压浓缩至浸膏状，加入适量CaO脱水、去酸。
2、将膏状物转移至坩埚，加热至100℃以上，待浓烟减少后，在坩埚上盖张滤纸开始升华，滤纸上出现的结晶状物即为咖啡因。
3、小心刮下咖啡因。
五、注意事项
1、浓缩萃取液时不可蒸得太干，否则因残液很粘而难于转移，造成损失。
2、拌入生石灰要均匀，生石灰的作用除吸水外，还可中和除去部分酸性杂质（如鞣酸）。
3、升华过程中要控制好温度。若温度太低，升华速度较慢，若温度太高，会使产物发黄（分解）。刮下咖啡因时要小心操作，防止混入杂质。
六、作业与思考题
1、简述用升华法从茶叶中提取咖啡因的优点，除此之外还可以用什么方法提取？ 2、记录实验现象和结果。
天然药物化学实验讲义
