地菇菌栽培技术
一、食用菌（微生物）的培养成败的关键――消毒灭菌。 消毒灭菌:可切断传播途径、控制感染扩散造成的危害；也可杀灭物品或器皿上的细菌，防止感染；是保证不受外来微生物污染的前提。 1．常用术语： （1）灭菌 是破坏和去除物体上所有微生物（包括病原微生物和非病原微生物）和细菌芽胞的方法。如外科器械、注射器、基础培养基灭菌等。 （2）消毒 是破坏物体上活的病原微生物的方法，但不包括细菌芽胞和非病原微生物。如用酒精溶液浸泡体温计、洁而灭液擦拭检查台等。用于消毒的化学物品称消毒剂(disinfectant)。一般而言,消毒对象是指物体而不是机体。 （3）防腐 直接使用防腐剂(antiseptics)破坏或抑制活病原微生物方法。如实验前碘液或酒精擦洗皮肤、双氧水清创伤口或杀菌肥皂清洗双手等应当使用该术语。
（4）无菌 防止感染病原体进入灭菌组织或物品的操作技术称无菌操作，无菌即为不存在活微生物。
2．物理消毒灭菌法
（1）热力消毒灭菌法 利用高热使蛋白质分子运动加快，肽链连接键断裂，蛋白变性凝固，细胞膜功能受损致胞内物质漏出，细菌内外环境平衡失调，从而导致微生物死亡。不同种类微生物对热的耐受力不同，有芽胞细菌对高温有强的抵抗力。
热力灭菌分干热灭菌法和湿热灭菌法两大类，相同温度下，湿热环境中菌体蛋白易凝固，穿透力比干热大，其蒸气变为液态时可释放潜热，迅速提高被灭菌物体的温度。
1）干热灭菌法 包括：①焚烧：直接点燃或在焚烧炉内进行，仅适用于废弃物品或动物尸体。②烧灼：直接以火焰灭菌，适用于微生物学实验室接种环、针和试管口等灭菌。③干烤 在干烤箱内进行，加热至150℃~180℃2~4h达到灭菌效果，适用于高温下不变质、不被破坏和不蒸发的物品，如玻璃器皿、瓷器，不能用于塑料、棉、纸制品。 2）湿热灭菌法 包括：
①巴氏消毒法：是用较低温度杀灭液体中的病原微生物或特定微生物而保持物品中所需的不耐热成分的方法。大多采用71.6℃加热15秒，用于牛乳消毒。
②煮沸法：在一个大气压下，煮沸后的水温度达100℃，煮沸5min后可杀死一般细菌繁殖体。 ③流通蒸气消毒法：又称常压蒸气消毒法，常用阿诺(Arnold)流通蒸气灭菌器或蒸笼，利用1个大气压下100℃水蒸气进行消毒，10~30min后细菌繁殖体被杀死，但对芽胞作用不大。 ④间歇灭菌法：采用间歇方式达到灭菌目的。将灭菌物品置于阿诺流通蒸气灭菌器内，100℃加热15~30min，每日一次，连续三次。每次灭菌后取出物品置37℃孵育箱过夜，致残存的芽胞发育成繁殖体，次日再通过流通蒸气灭菌器加热而被杀灭。如此反复以达到杀灭芽胞又使不耐高温的物质免受影响。常用血清凝固器对吕氏血清培养基和鲁琴培养基的灭菌属此方法。
⑤高压蒸气灭菌法 利用密闭的耐高压蒸气灭菌器(autoclave),在蒸气不外溢的条件下，使锅内压力增高，随之蒸气温度也增高。通常在103.4kpa压力下蒸气温度达到121.3℃, 维持15~20min可杀灭所有的繁殖体和芽胞。本法适用于耐高温、耐湿物品的灭菌，如普通培养基、生理盐水、手术敷料等。 （2）辐射法
1）电离辐射 能产生电离辐射效应的有X射线、Γ射线、阴极射线。受照射后，敏感的靶物质如
细菌DNA吸收了射线产生能量，产生较大范围的突变，或产生毒性物质如自由基可破坏微生物核酸产生致死作用。电离辐射由于灭菌时不产生热量又称“冷灭菌法”，适用于对热敏感的物品及化学物质的灭菌,如一次性医用塑料制品和移植组织（骨、皮肤、心瓣膜等）和食品灭菌。 2）非电离辐射
①紫外线 杀菌紫外线波长为240~280nm，它作用于DNA链上相邻两个胸腺嘧啶或胞嘧啶，共价结合形成二聚体而干扰DNA复制与转录，导致细菌的死亡。紫外线穿透力弱，故常用于空气消毒和不耐热物品表面消毒。
②微波 是波长为1~103 nm的电磁波，可穿透玻璃、陶瓷、塑料薄膜等物质，常用于检验室用品、食品食具、药杯及其他用品的消毒。 （3）声波 超声波的空化作用破坏了细菌原生质胶体状态导致细菌裂解。革兰阴性菌对其敏感。主要用于细菌细胞粉碎以提取细胞的组分或制备抗原。
（4）滤过除菌法 以物理阻留的方式将液体或空气中的微生物除去以达到无菌目的。用于不耐高温物品如血清、抗毒素、抗生素等的灭菌，超静工作台和层流室空气也用滤过法除菌。
3．化学消毒灭菌法 化学药物使菌体蛋白变性沉淀、干扰微生物酶系统影响其代谢和损伤细菌细胞膜，导致菌体内容物漏出，而发挥防腐、消毒和灭菌作用。只能外用或用于环境物品的消毒。 （1）化学消毒剂的种类：
1）根据化学结构与性质不同分类 可以分成酶类、醇类、重金属盐类、氧化剂、表面活性剂、烷化剂、染料、酸碱类等。
2）根据杀灭微生物作用强弱分类：
①高效消毒剂 可杀灭一切微生物。如戊二醛、甲醛、环氧乙烷、过氧乙酸等。 ②中效消毒剂 杀灭除芽胞以外的微生物。如乙醇、碘伏等。
③低效消毒剂 不能杀灭芽胞、结核分枝杆菌。如氯己定、苯扎溴铵等。
（2）影响消毒剂效能的因素 通常消毒剂的浓度和作用时间与消毒剂杀灭微生物的效能成正相关，但也有例外，如乙醇，其浓度为70~75%时杀菌力最强。影响消毒剂作用的因素有①消毒剂的性质、浓度和作用时间；②微生物的种类与数量；③温度与湿度；④酸碱度；⑤环境中有机物存在的拮抗；⑥其他化学拮抗物质。 （3）常用化学消毒剂的应用
①卤素化合物 是有效的杀菌和灭菌剂，用于水、食品、设施消毒。如碘伏常用作于皮肤的除菌。 ②酚类化合物 是强效杀菌剂，通常用于物品消毒。 ③醇类 一般起抑菌作用。
④过氧化氢 用于伤口防腐和器具消毒。高浓度的过氧化氢有杀灭芽胞性能。 ⑤表面活性剂 用于皮肤粘膜除菌和器具消毒。 ⑥醛类 破坏微生物酶系统，有潜在灭菌作用。 ⑦烷化剂 具高效的杀菌性能，是高效杀菌剂。 二、培养基 （一）、培养基种类：
由于各种所需要的营养不同，所以培养基的种类很多。据估计目前约有数千种不同的培养基，这些培养基可根据所含成分、物理状态、以及不同的使用目的等而分成若干类型。 1.按照培养基的成分来分
培养基按其所含成分，可分为合成培养基、天然培养基和半合成培养基三类。
(1)合成培养基。合成培养基的各种成分完全是已知的各种化学物质。这种培养基的化学成分清
楚，组成成分精确，重复性强，但价格较贵，而且微生物在这类培养基中生长较慢。如高氏一号合成培养基、察氏（Czapek）培养基等。
(2)天然培养基。由天然物质制成，如蒸熟的马铃薯和普通牛肉汤，前者用于培养霉菌，后者用于培养细菌。这类培养基的化学成分很不恒定，也难以确定，但配制方便，营养丰富，所以常被采用。
(3)半合成培养基。在天然有机物的基础上适当加入已知成分的无机盐类，或在合成培养基的基础上添加某些天然成分，如培养霉菌用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。这类培养基能更有效地满足微生物对营养物质的需要。 2.按照培养基的物理状态分
培养基按其物理状态可分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基三类。
(1)固体培养基。是在培养基中加入凝固剂，有琼脂、明胶、硅胶等。固体培养基常用于微生物分离、鉴定、计数和菌种保存等方面。
(2)液体培养基。液体培养基中不加任何凝固剂。这种培养基的成分均匀，微生物能充分接触和利用培养基中的养料，适于作生理等研究，由于发酵率高，操作方便，也常用于发酵工业。 (3)半固体培养基。是在液体培养基中加入少量凝固剂而呈半固体状态。可用于观察细菌的运动、鉴定菌种和测定噬菌体的效价等方面。 3.按照微生物的种类分
培养基按微生物的种类可分为细菌培养基、放线菌培养基、酵母菌培养基和霉菌培养基等四类。 常用的细菌培养基有营养肉汤和营养琼脂培养基；常用的放线菌培养基为高氏1号培养基；常用的酵母菌培养基有马铃薯蔗糖培养基和麦芽汁培养基；常用的霉菌培养基有马铃薯蔗糖培养基、豆芽汁葡萄糖（或蔗糖）琼脂培养基和察氏培养基等。 4.按照培养基用途分 培养基按其特殊用途可分为加富培养基、选择性培养基和鉴别培养基。
(1)加富培养基。是在培养基中加入血、血清、动植物组织提取液，用以培养要求比较苛刻的某些微生物。
(2)选择性培养基。是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。
(3)鉴别培养基。是在培养基中加入某种试剂或化学药品，使培养后会发生某种变化，从而区别不同类型的微生物
三、培养基的制备过程：计算→称量→溶化→灭菌→倒平板（记忆）
一般培养基的程序主要可分为：配料、 溶化、矫正pH 、澄清过滤、分装、灭菌及检定等8 个步骤。
（一） 配料
按培养基处方准确称取各种成分，先在三角烧瓶中加入少量蒸馏水，再加入各种成 分，以防蛋白胨等粘附于瓶底，然后再以剩余的水冲洗瓶壁。 （二） 溶化
将各种成分混匀于水中，最好以流通蒸气溶化半小时，如在电炉上溶化应随时搅 拌，如有琼脂成分时更应注意防止外溢。溶化完毕，补足失去的水分。 （三） 矫正pH 1．pH 测定
取 与标准管同口径的试管 （通常用华氏试管）3 支，于第1 、3 管各加入欲测定pH 的的培养
基5ml，并于第一管中加入0．2g／L 的酚红0．25ml 作为测定管，混匀；于第2 管加入蒸馏水5ml ，第4 管为pH 标准比色管，分别按图59 －1 插入比色架内进行比色。 2．pH 的校正
若测定管过酸或过碱可用0．1mol／L 氢氧化钠或0．1mol／L 盐酸溶液矫正，直至颜色 与标准管相同为止，加碱或加酸时要精确缓慢，每加1 滴后要充分混匀，比色后再加第2 滴 （有时仅加半滴） 准确记录加入的量。 3．计算
设5 ml 培养基矫正pH 至7．4 时需0．1mol／L 氢氧化钠0．15ml，现有培养基4990 ml ， 需加氢氧化钠的量可按下列方法计算：5∶4990 ＝0．15∶X X ＝0．15 ×4990/5＝149．7 （ml）
如将此0．1mol／L 的氢氧化钠改用1mol／L 的氢氧化钠时，则需14．9ml 即可。 （四） 过滤澄清
培养基配制后一般都有沉渣或混浊出现，需过滤成清晰透明后方可使用，常用的过 滤方法如下： 1．液体培养基
液体培养基必须清晰，以便观察细菌的生长情况，常用滤纸过滤，亦可在加热前加 入用水稀释的鸡蛋白 （1000ml 培养基用1 个鸡蛋白） 在100 ℃加热后保持60 ～70 ℃40 ～ 60 分钟，使其不溶性物质附于凝固的蛋白上而沉淀，然后再用虹吸法吸出上清液或以 滤纸过滤。 2．固体培养基
如系琼脂培养基，于加热融化后需趁热以绒布或两层纱布中夹脱脂棉过滤；亦可用
自然沉淀法，即将琼脂培养基盛人铝锅或广口搪瓷容器内，以高压 （103．43kPa） 蒸汽 融化15 分钟后，静置高压锅内过夜，次日将琼脂倾出，用刀将底部沉渣切去，再融化 即可收清晰的琼脂培养基。 （五） 分装
1．根据需要将培养基分装于不同容量的三角烧瓶、试管中。分装的量不宜超过容 器的2／3 以免灭菌时外溢。
2．琼脂斜面分装量为试管容量的1／5 ，灭菌后须趁热放置成斜面，斜面长约为试管 长的2／3 。
3．半固体培养基分装量约为试管长的1／3 ，灭菌后直立凝固待用。
4．高层琼脂分装量约为试管的1／3 ，灭菌后趁热直立，待冷后凝固待用。 5．液体培养基分装于试管中，约是试管长度的1／3 。
6． 琼脂平板：将灭菌 （或加热融化） 后的培养基冷至50 ℃左右，以无菌手续倾人 灭菌平皿内，内径9cm 的平皿倾注培养基约13 ～15ml ，轻摇平皿底，使培养基平铺于平 皿底部，待凝固后即成，倾注培养基时，切勿将皿盖全部启开，以免空气中尘埃及细菌 落入。 新制成的平板培养基 （简称平板），表面水分较多，不利于细菌的分离，通常应将 平皿倒扣搁置于37 ℃培养箱内约30 分钟待平板平面干燥后使用。平板的放置：倒置。（原因：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。） （六） 灭菌
不同成分、性质的培养基，可采用不同的灭菌方法。 高压蒸汽灭菌法：高压灭菌的温度与时间随培养基的种类及数量的不同有所差别，
一般培养基少量分装时高压 （103．43kPa） 灭菌15 分钟即可，培养基分装量较大时，可 高压
（103．43kPa） 灭菌30 分钟，含糖的培养基高压 （55．16kPa） 灭菌15 分钟。以免糖 类被破坏。
（七） 检定
每批培养基制成后须经检定方可使用，检定时将培养基放37 ℃温箱内培养24 小时 后，证明无菌，同时用已知菌种检查在此培养基上生长繁殖及生化反应情况，符合要求 者方可使用。 （八） 保存
制好的培养基，不宜保存过久，以少量勤做为宜。每批应注明名称，分装量，制作 日期等，放在4 ℃冰箱内备用（短期保存）。长期保存：甘油管藏法（在3mL的甘油瓶中，装入1mL甘油后灭菌。将1mL培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在－20℃的冷冻箱中保存）。 四、平菇菌种制作技术
（一）.平菇母种的制作
平菇母种配方：土豆 200 克、白糖 20 克、琼脂 20 克、水 1000 毫升、蛋白胨3克、硫酸镁 2 克、维生素 2 克。按配方精确称取，先将土豆去皮切片放入 1000 毫升水中，用文火煮沸 20 分钟左右。然后过滤，加水再加热，先将琼脂、白糖、硫酸镁、维生素煮至全部溶化，用量杯量一下是否还够 1000 毫升，如不足，用开水补足。趁热分装试管中，每管装 12毫升， 1000 毫升可分装 80---100 支试管。分装时要用长管 漏斗，不要使培养基沾到试管口上，以免沾湿棉塞污染杂菌。塞棉塞要用普通棉花，塞 入试管要松紧合适。然后，每 10 支试管用皮套捆成一小捆，每 5 小捆再捆成一大捆，棉塞用牛皮纸包好，放入高压锅中 1.2 公斤压力，灭菌 30 分钟，停火。等 压力表回零才能排气开锅，取出试管倾斜排放在桌面上，斜面试管有两种：原母种试管 ----- 斜 面长度应为管长的 1/3 ，生产母种试管的斜 面应为管长的 1/2 ，冷却凝固后，取一些试管放入恒温箱中 27--30 度空白培养 5天，经无菌观察，确认无杂菌，才能大量用于分离制种或转接生产母种。接种要在严格的无菌条件下进行可以使用甲醛加高锰酸钾消毒法，接种后放入 25 度的恒温箱中培养 7---10 天，长满试管确认无任何杂菌，就可用于转接二级原种了。 （二）.平菇原种制作
配方 1 ：阔叶木锯沫 80 斤、玉米面 25 斤、克霉灵 1 两、白糖 1 斤、硫酸镁 5 两、磷酸二氢钾 3 两、石膏1 斤、碳酸钙 1 斤。含水量 65% 。 配方2 ：玉米芯 80 斤、稻糠 15 斤、夫子 10 斤、克霉灵 1 两、白糖 1 斤、硫酸镁 5 两、磷酸二氢钾 2 两、尿素 3 两、石灰 2 斤。含水量 65% 。
配方 3 ：阔叶木锯沫 40 斤、玉米芯 40 斤、豆饼粉 10 斤、玉米面 10 斤、白糖 1 斤、克霉灵 1 两、硫酸镁5 两、菇丰素 15 克、二氢钾 3 两、碳酸钙 1 斤、石灰 1 斤。 含水量 65%.
配方 4 ： 玉米 100 斤，磷酸二氢钾 0 。 5 斤，硫酸镁 0 。 5 斤，白糖 1 斤，碳酸钙 2 斤， 629 消毒剂1 瓶。
拌料：先将主料和夫子或玉米面、石膏、白灰干拌均匀。然后将其它药品溶化于水中，形成浓的原液。然后把原液均匀加入水中拌入料里。拌匀、含水量掌握在 65% ，即拌完料后用手握一把料，手指缝有水滴但不下落。最好用“亚泰牌装袋机”拌料，节省劳力、搅办均匀，而且还可以装多种规格的菌袋，一机多用。
装瓶标准： 每瓶能装干料 2.5 两，装完湿料连瓶称重应为 1.1 斤，这就证明装料量、松紧度都要适度。料中间打一个眼以利菌丝快速生长，装完瓶后马上擦净瓶身，盖上丙烯塑料，套好皮套，进行高压灭菌 1.5 公斤压力保持 2 小时以上。灭菌结束后，瓶温降到 30 度以下搬入接种箱中，接种前必须进行严格消毒 ---- 用 629 消毒剂或气雾消毒盒或电子接种器配合使用。一
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