衔接蛋白2敲除对AT1受体介导的AngⅡ内
吞的阻碍
张勇 娄冬梅 康劲松 刘全
【摘要】 目的 通过RNAi沉默AP2
μ2亚单位的表达，观看其
μ2
是不是阻碍AT1R介导的AngⅡ内吞。方式 通过设计构建的AP2
RNAi表达载体，转染H9C2细胞，通过Western印迹验证沉默成效;激光共聚焦显微镜观看沉默AP2
μ2基因对AT1R介导的AngⅡ内吞的
μ2蛋白表达的
μ
阻碍。结果 蛋白质水平检测siRNA重组质粒对AP2阻碍，可见pSH1Si
AP2 plasmid
1表达质粒可明显抑制AP2
2蛋白表达。给予AngⅡ不同时刻点，可见其在15 min时受体内吞至胞内数量最多。重组质粒沉默AP2
μ2亚单位后，外源加入AngⅡ后，
可明显抑制AT1R介导的AngⅡ内吞。 结论 AT1R介导AngⅡ内吞的发生，与其他GPCR一样，要紧通过网格蛋白依托的内吞方式进行，而且需要AP2蛋白参与。
【关键词】 衔接蛋白2;内吞;血管紧张素Ⅱ;AT1R
受体介导的内吞(Receptor
mediated endocytosis)是目前公认
的生物体摄取细胞外大分子的要紧途径。最近几年发觉G蛋白偶联受体(GPCRs)的内吞对受体功能调剂亦超级重要。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和其GPCRs
血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)一直被以为介导了心血管
疾病和代谢性疾病的终末器官损害〔1〕，二者在细胞膜上结合后通过受体内吞的形式进入细胞内。最近几年来，人们在探讨肾素
血管紧
张素系统(RAS)对靶器官和组织病理生理作用的细胞内信号转导机制时，以为AngⅡ与AT1R除在细胞膜上结合激活下游信号转导，二者还可能通过AT1R介导的内吞进入细胞内继续发挥生物学作用。
衔接蛋白2(Adaptor protein 2，AP2)是细胞膜表面最要紧的衔接蛋白，由2个大亚基(α和β2)，一个中亚基(μ2)和一个小亚基(σ2)组成〔2〕。有研究报导用siRNA技术抑制AP2 μ2亚单位的表达可明显抑制转铁蛋白受体(Transferrin Receptor)的内吞〔3〕。转铁蛋白受体与AT1R同为GPCRs，提示AP2是不是也参与了AT1R介导的AngⅡ内吞的进程。因此，本实验通过RNAi技术沉默AP2 μ2亚单位的表达，观看是不是阻碍AT1R介导的AngⅡ内吞，为进一步研究AngⅡ与AT1R在细胞内的信号转导作用提供理论依据。
1 材料与方式
材料和试剂 AngⅡ抗体由日本大阪医科大学药理教研室的金德男教授惠赠;β公司;AP2
actin和荧光二抗等抗体购自美国SANTA CRUZ
μ2抗体(AP50)购自美国BD公司。溴化乙锭、SDS、TEMED、
丙烯酰胺、N，N-二甲基双丙烯酰胺、PMSF购自美国Sigma公司;DAB、TritonX
100、Tween20购自北京鼎国生物技术;胰酶、DMEM培育基
为美国Hyclone公司产品;小牛血清购自美国Gibco公司;蛋白酶抑制剂购自大连宝生物工程公司;其他常规化学试剂均为分析纯产品。大鼠心肌细胞株H9C2购自中国科学院细胞库。
方式
蛋白质水平检测siRNA重组质粒对AP2
μ2蛋白表达的阻μ2基因siRNA
碍 在前期实验中，本实验室已经成功构建了3条AP2表达载体(pSH1Si
AP2)(论文待发表)，经测序未见错配和丢失碱
AP2表达质粒向H9C2细胞的转染，提
μ2蛋白表达。将细胞分为1组、AP2 plasmid
2
基。在6孔板中完成pSH1Si
取细胞总蛋白，Western 印迹检测AP2正常对照组、阴性对照组、AP2 plasmid组、AP2 plasmid
3组共5组。以β
actin表达水平作为等量蛋
PAGE电泳，转至硝
白质上样对照，取60 μg蛋白质样品进行SDS
酸纤维素膜上;室温封锁2 h后，用含% Tween20的TBS缓冲液(TBST)漂洗3次，每次10 min;加入相应的AP2
μ2抗体(1∶200)，4℃孵
育留宿，TBST漂洗3次后加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶1 000)，37℃摇床温育2 h，最后经DAB显色，凝胶图像分析系统分析蛋白的表达。
给予AngⅡ不同时刻点观看其在H9C2细胞内的内吞转变进程 将适合尺寸的盖玻片高压灭菌，放入24孔板内，种入适宜的细胞
衔接蛋白2敲除对AT1受体介导的AngⅡ内吞的阻碍
