动物免疫学实验指导
表3-1 溶血试验（单位：ml ）
试管号 2%红细胞 溶血素 补 体 生理盐水 结 果
1 0.5 0.5 0.5 — 溶血
2 溶血素对照
0.5 0.5 — 0.5 不溶血
3 补体对照 0.5 — 0.5 0.5 不溶血
4 盐水对照 0.5 — — 1.0 不溶血
5 补、溶对照
0.5 0.5 0.5* — 不溶血
注：* 56℃ 30min灭活的补体。
[思考题]
1. 溶血试验中，第2、3、4、5管是什么对照？为什么要设这些对照？ 2. 溶血试验的原理是什么？
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实验四 病毒的血凝及血凝抑制试验
有些病毒具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集(HA)试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(HI)试验，具有特异性。通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。 [目的要求]
掌握病毒HA和HI试验的原理和基本操作方法，了解其实用价值。 [材料与试剂]
1. 96孔“U”形或“V”形微量反应板，50?L定量移液器，滴头，微型振荡器。 2. 生理盐水，0.5% 鸡红细胞悬液。
3. 新城疫病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），新城疫阳性血清，被检鸡血清。 [实验内容及操作方法]
（一）血球凝集(HA)试验
1. 在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50?L生理盐水。
2. 于左侧第1孔加50?L病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），混合均匀后，吸50?L至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃50?L；第12孔为红细胞对照。
3. 自右至左依次向各孔加入0.5% 鸡红细胞悬液50?L，在振荡器上振荡，室温下静置后观察结果（表4-1）。
表 4-1 病毒血凝试验的操作方法（单位：?L）
孔 号 病毒稀释度 生理盐水 病毒液 0.5%红细胞1 1:2 50 50 502 1:4 50 50 503 1:8 50 50 504 5 6 7 8 9 10 11 12 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 对照 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 5050 50 50 弃50
结果观察 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ + + - - 11
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4. 结果判定：从静置后10 min开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100% 凝集（++++），不凝集者（-）红细胞沉于孔底呈点状。
以100% 凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。从表4-1看出，该新城疫病毒液的血凝价为1:128，则l:128为1个血凝单位，1:64、l:32分别为2、4个血凝单位，或将128/4=32，即1:32稀释的病毒液为4个血凝单位。
(二) 血球凝集抑制(HI)试验
1. 根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝单位的病毒液。
2. 在96孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，自第1孔至第11孔各加50?L生理盐水。
3. 第１孔加被检鸡血清50?L，吹吸混合均匀，吸50?L至第2孔，依此倍比稀释至第10孔，吸弃50?L，稀释度分别为：1:２、1:4、1:8 …… ；第12孔加新城疫阳性血清50?L，作为血清对照。
4. 自第1孔至12孔各加50?L 4个血凝单位的新城疫病毒液，其中第11孔为4单位新城疫病毒液对照，振荡混合均匀，置室温中作用10min 。
5. 自第l孔至12孔各加0.5% 鸡红细胞悬液50?L，振荡混合均匀，室温下静置后观察结果（表4-2）。
表4-2 病毒血凝抑制试验的操作方法（单位：?L）
孔 号 血清稀释度 生理盐水 1 1:2 502 1:4 50 50 503 1:8 50 50 504 5 6 7 8 9 10 11 病毒 对照 50 50 12 血清 对照 50 50 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50被检鸡血清 504单位病毒 50室温中静置 10 min 0.5%红细胞 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 弃去50 结果观察 - - - - - - + ++ +++ ++++ ++++ - 50
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6. 结果判定：待病毒对照孔（第11孔）出现红细胞100%凝集（++++），而血清对照孔（第12孔）为完全不凝集（-）时，即可进行结果观察。
以100％抑制凝集（完全不凝集）的被检血清最大稀释度为该血清的血凝抑制效价，即HI效价。凡被已知新城疫阳性血清抑制血凝者，该病毒为新城疫病毒。
从表4-2看出，该血清的HI效价为1:64，用以2为底的负对数(-log2)表示，即6log2。
附 录
1. 阿氏液（Alsever）：即红细胞保养液
枸橼酸钠（5H2O） 0.80g 枸橼酸（H2O） 0.055g 葡萄糖 2.05g 氯化钠 0.42g 双蒸水 加至 100 ml
将以上试剂加热溶解于双蒸水中，调整pH至6.8，115℃灭菌10min,4℃保存备用。 2. 0.5% 鸡红细胞制备方法
先用灭菌注射器吸取3.8% 枸橼酸钠溶液(其量为所需血量的1／5)，从鸡翅静脉或心脏采血至需要血量，置灭菌离心管内，加灭菌生理盐水为抗凝血的2倍，以2000r/min离心10min，弃上清液，再加生理盐水悬浮血球，同上法离心沉淀，如此将红细胞洗涤三次，最后根据所需用量，用灭菌生理盐水配成0.5% 鸡红细胞悬液。
3. 96孔微量反应板的清洗
将浸泡有75% 乙醇的棉签放入微量反应板的每个孔内旋转，用自来水冲洗反应板5次，再用蒸馏水冲洗3次以上，置37℃温箱中干燥。
[思考题]
1. HA和HI试验的原理是什么？
2. HI试验是不是特异的抗原抗体反应，为什么? 3. HA和HI试验有何实际应用意义？
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实验五 E-玫瑰花环试验
动物的T淋巴细胞具有结合红细胞的性质，其分子基础是T细胞表面存在CD2分子，也就是红细胞受体，多数动物的T细胞是绵羊红细胞受体，而豚鼠、马的T细胞是家兔红细胞受体，因此红细胞能粘附到T细胞周围形成一朵玫瑰花样的花环，故取名为E-玫瑰花环（erythrocyte rosettes），即红细胞玫瑰花环，该试验称为E-玫瑰花环试验（erythrocyte rosettes assay）。凡能与红细胞形成E-玫瑰花环的淋巴细胞简称为E-花环形成细胞。该试验可用于计数或分离E-花环形成细胞以及测定机体的细胞免疫状态。 [目的要求]
1. 掌握E-玫瑰花环试验的原理及操作方法。 2. 熟悉淋巴细胞的分离方法。 [材料与试剂]
1. 试管，离心管，毛细管，吸管，注射器，载玻片，血球计数板，豚鼠，家兔等。 2. 淋巴细胞分层液，无钙、镁的Hank’s液，肝素液，小牛血清。
3. 0.8% 戊二醛溶液：25% 戊二醛溶液0.32ml，Hank’s液9.68 ml，用前配制。 4. Giemsa-Weight 染色液：Ⅰ液：Weight粉0.1g加甲醇60 ml ，研磨混匀；Ⅱ液：Giemsa粉0.5g溶于纯甘油33 ml 中，置60℃温箱，最后加甲醇33 ml 即可；使用时，分别将Ⅰ液和Ⅱ液用pH6.4的PBS稀释1倍。 [实验内容及操作方法]
(一) 豚鼠淋巴细胞的制备 1. 方法1
取豚鼠肝素抗凝血3 ml，沿离心管壁轻轻地加入到 3 ml 的淋巴细胞分层液的上面，使二层液体的界面不相混合；于水平转子离心机中，2000r/min离心20min，离心后分为四层，上层为血浆，此层与分层液液面交界处有一云雾状层，即为淋巴细胞层，云雾状层之下为淋巴细胞分层液，底层主要为红细胞，用毛细管轻轻地把淋巴细胞层吸入另一试管中；用5倍Hank’s 液反复洗涤淋巴细胞2次，每次2000r/min 离心10min；若第一次离心后，沉淀的淋巴细胞中有少量红细胞，可加蒸馏水l ml 左右，振摇1min，使红细胞破裂，然后立即加Hank’s液4 ml 左右，混匀，2000r/min 离心10min，弃上清液，继续用Hank’s液洗涤一次；
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