动物免疫学实验指导
动物免疫学实验指导
第二版
徐春厚 谢为天 雍艳红 编 动物医学 生物技术专业用
广东海洋大学教材科出版 二00七年二月二十八日
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动物免疫学实验指导
目 录
实验一实验二实验三实验四实验五实验六实验七实验八实验九实验十
凝集试验………………………………………………………1 沉淀试验………………………………………………………4 溶血试验………………………………………………………8 病毒的血凝及血凝抑制试验 ………………………………10 玫瑰花环试验 ……………………………………………13 玫瑰花环试验 ……………………………………………15 玫瑰花环试验……………………………………………17 酶联免疫吸附试验 …………………………………………18 荧光抗体技术 ………………………………………………20 多克隆抗体（免疫血清）的制备 …………………………22
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实验一 凝集试验
颗粒性抗原(细菌、螺旋体、红细胞等)与相应抗体结合后，在有适量电解质存在下，抗原颗粒可相互凝集成肉眼可见的凝集块，称为凝集反应(Agglutination reaction)或凝集试验。参与凝集反应的抗原称为凝集原（Agglutinogen），抗体称为凝集素（Agglutinin）。
细菌或其它凝集原都带有相同的负电荷，在悬液中相互排斥而呈现均匀的分散状态。抗原与相应抗体相遇后可以发生特异性结合，形成抗原抗体复合物，降低了抗原分子间的静电排斥力，此时已有凝集的趋向，在电解质（如生理盐水）参与下，由于离子的作用，中和了抗原抗体复合物外面的大部分电荷，使之失去了彼此间的静电排斥力，分子间相互吸引，凝集成大的絮片或颗粒，出现了肉眼可见的凝集反应。根据是否出现凝集反应及其程度，对待测抗原或待测抗体进行定性、定量测定。
凝集反应包括直接凝集反应和间接凝集反应两大类，本实验主要介绍直接凝集反应。 [目的要求]
1. 掌握平板凝集试验和试管凝集试验的操作方法。 2. 掌握凝集试验的结果判定及判定标准。
3. 熟悉平板凝集试验和试管凝集试验所需材料和试剂。 [材料与试剂]
1. 玻板，载玻片，试管（1cm x 8cm），试管架，刻度吸管，滴管，微量可调加样器，滴头（tip头），牙签或火柴棒，记号笔。
2. 灭菌的生理盐水，灭菌的0.5%石炭酸生理盐水。
3. 布氏杆菌病试管凝集抗原，布氏杆菌病平板凝集抗原，布氏杆菌病虎红平板凝集抗原，布氏杆菌病阳性血清，布氏杆菌病阴性血清，被检血清（牛、羊或猪）。
4. 鸡白痢平板凝集抗原，鸡白痢阳性血清，鸡白痢阴性血清，被检鸡血清。 [实验内容及操作方法]
（一）试管凝集试验
以牛布氏杆菌病试管凝集试验为例。
1. 试管准备：每份血清用试管4支，另取3支试管作为对照，作好标记，置试管架上。如被检血清有多份，对照只需做1份。
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2. 被检血清稀释：第1管加入2.3 ml 0.5% 石炭酸生理盐水，第2、3、4管加入0.5 ml 0.5% 石炭酸生理盐水；然后用加样器或刻度吸管吸取被检血清0.2 ml ，加入第1管中，反复吹吸5次混匀，吸取1.5 ml 弃之，再吸取0.5 ml 加入第2管中，混匀后吸取0.5 ml 加入第3管，依此类推至第4管，混匀后吸弃0.5 ml （见表1-1）。该被检血清的稀释度分别是1:12.5、1:25、1:50、1:100。
3. 对照管制作：第5管中加0.5% 石炭酸生理盐水0.5 ml ，第6管加1:25稀释的布氏杆菌病阳性血清0.5 ml ，第7管加1:25稀释的布氏杆菌病阴性血清0.5 ml 。
4. 加抗原：将布氏杆菌病试管凝集抗原用0.5% 石炭酸生理盐水作1:20稀释，每支试管加0.5 ml 。
表1-1 布氏杆菌病试管凝集试验术式表（单位：ml）
试 管 号 最终血清稀释度 0.5%石炭酸生理盐水 1 1：25 2.3 0.2 0.5 2 1：50 0.5 0.5 0.5 3 1：100 0.5 0.5 0.5 4 1：200 抗 原 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 1：25 0.5 0.5 1：25 0.5 0.5 5 6 对 照 管 阳性血清 阴性血清 7 被检血清 抗原(1：20)弃1.5 弃0.5 5. 感作（反应）：7支试管加完抗原后，充分混匀，置于37℃温箱中4-10h，取出后置室温18-24h（或37℃温箱12-14h，取出后置室温2-4h；或37℃温箱中22-24 h取出），然后观察并记录结果。
6. 结果判定：判定结果时用“+”表示反应的强度。根据各管中上清液的透明度、抗原被凝集的程度及凝集块的形状，来判定凝集反应的程度。
＋＋＋＋：100％抗原凝集，上清液完全透明，菌体完全被凝集呈伞状沉于管底，振荡时，沉淀物呈片状、块状或颗粒状。
＋＋＋：75％抗原凝集，上清液略呈混浊，菌体大部分被凝集沉于管底，振荡时情况如上。（管底凝集物与100%凝集时相同，只是上清液稍浑浊）。
＋＋：50％抗原凝集，上清液浑浊半透明，管底有中等量的凝集物（管底有明显的凝集）。 ＋：25％抗原凝集，上清液完全浑浊不透明，管底有少量凝集物或凝集的痕迹。
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－：抗原完全未凝集，上清液完全浑浊不透明，但由于菌体的自然下沉，在管底中央出现规则的菌体自沉圆点，振荡后立即散开呈均匀混浊。
7. 判定标准：能使50% 抗原凝集的血清最高稀释度称为该血清的凝集价（或称滴度）。 牛、马和骆驼的血清凝集价大于或等于1:100，判为阳性，1:50的凝集价判为疑似反应（可疑）；猪、绵羊、山羊和狗的血清凝集价大于或等于1:50，判为阳性，1:25的凝集价判为疑似反应（可疑）。 [注意事项]
1. 实验时必须设抗原、阳性血清及阴性血清对照，以避免假阳性、假阴性的结果。 2. 结果判为可疑时，隔2-3周后采血重做。阳性畜群，重检时仍为可疑，可判为阳性。对同群中既无临床症状又无凝集反应阳性者，马、猪重检仍为可疑，判阴性；牛、羊重检仍为可疑者，可判为阳性，或以补体结合反应核对。
（二）布氏杆菌病平板凝集试验
1. 加血清：取洁净玻板一块，用蜡笔划成方格（4cm），并注明被检血清号码，以100?L微量可调加样器按下列量加被检血清于方格内，第l格80?L、第2格40?L、第3格20?L、第4格10?L。血清用前需放室温，使其温度达20℃左右。每一份检样需换一个tip头。
大规模检疫时，允许只用两个血清量作试验，牛、马、骆驼用40?L 和20?L ；猪、山羊、绵羊、狗用80?L和40?L。
2. 加抗原：每格加布氏杆菌病平板凝集抗原30?L，滴在血清附近，而不与血清接触。从血清量最少的一格起，用牙签将血清与抗原混匀，一份血清用一根牙签。
抗原用前摇匀，并置室温使其温度达20℃左右。
3. 作用：混和完毕后，将玻板置恒温箱中或采用别的办法适当加温，使温度达到30℃左右，3-5min内记录反应结果。
4. 对照：每次试验须用标准阳性血清和阴性血清以及生理盐水作对照。 5. 结果判定：按下列标准记录反应结果。
＋＋＋＋：出现大的凝集块，液体完全透明，即100% 凝集。 ＋＋＋：有明显凝集块，液体几乎完全透明，即75% 凝集。 ＋＋：有可见凝集块，液体不甚透明，即50% 凝集。 ＋：液体混浊，有小的颗粒状物，即25% 凝集。 －：液体均匀混浊，无凝集现象。
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