医学免疫学实验指导
实验五凝集反应
由长沙达尔锋生物科技有限公司整理
【文章介绍】
实验是映证理论，对学生进行基本技能训练和培养科学研究能力的手段。BioRike博瑞克根据《医学免疫学实验指导》一书系统整理了14个实验项目，每个实验说明实验目的，实验原理，实验内容方法，实验要求及注意事项，希望广大师生能够从中有所收获。
BioRike简介：BioRike（中文简称“博瑞克”）是长沙达尔锋生物科技有限公司旗下的产品品牌,由旗下专业的生命科学实验室BioRike博瑞克研发和生产。BioRike是一家致力于生命科学和生物技术领域的高科技实验室，专门从事以Elisa试剂盒、抗体、细胞因子、免疫检测试剂盒、血清等免疫学产品为主的生物试剂的研发与销售。 【实验目的】
1.了解凝集反应的原理、基本类型及其用途。
2.熟悉玻片凝集试验、试管凝集试验、间接凝集试验的实验方法和结果分析。 【实验用品】
1. 材料试剂：伤寒杆菌、大肠杆菌18～24小时琼脂斜面培养物、伤寒杆菌H血清、伤寒杆菌H菌液、待测孕妇尿液、HCG阳性孕妇尿液、1:10稀释伤寒杆菌诊断血清、ABO血型标准血清、类风湿免疫诊断试验（用变性IgG致敏的乳胶颗粒）、HCG致敏乳胶试剂、兔抗HCG诊断血清、待测血清、生理盐水。
2.器材：洁净载玻片、巴氏吸管、乳胶皮头、接种环、酒精灯、特种铅笔（或记号笔）、小试管、牙签、采血针、75%酒精棉球、无菌干棉球、试管架；1ml、5ml刻度吸管、37℃恒温箱（或37℃/56℃水浴箱）、显微镜。 【内容和方法】
一、玻片凝集试验(slide agglutination) 1.原理
玻片凝集试验(slide agglutination)是将已知的抗体直接与未知的颗粒性抗原物质(如细菌、立克次体、钩端螺旋体等)混合，在有适当电解质存在的条件下，如两者对应便发生特异性结合而形成肉眼可见的凝集物，即为阳性；如两者不对应便无凝集物出现，即为阴性。此法属定性试验，主要用于检测抗原，如ABO血型鉴定、细菌鉴定和分型等。 2.方法
（1）取载玻片一张（平置实验台上），用特种铅笔或记号笔划分为3格，并标明1、2、3。 （2）取巴氏吸管一支，套上乳胶皮头后，吸取1:10 稀释的伤寒杆菌诊断血清1～2 滴于第1、2 格内，另取巴氏吸管一支，吸取生理盐水1～2 滴于第3格内。
（3）将接种环在酒精灯火焰上烧灼灭菌，冷却后取少许伤寒杆菌菌培养物与第1、3格内的诊断血清、生理盐水混合并涂抹成均匀悬液。然后用同样方法取少许大肠杆菌培养物与第2格内的的诊断血清混合并涂抹成均匀悬液。静置数分钟后观察结果。 3.结果观察与判定
如上述混合悬液由均匀混浊状变为澄清透明，并出现大小不等的乳白色凝集块者即为阳性（＋）；如混合物仍呈均匀混浊状则为阴性（－）。如肉眼观察不够清楚，可将玻片置于显微镜下用低倍镜观察。
本次实验结果第1 格内应出现大小不等的乳白色凝集物（阳性），第2、3格内无凝集物，混合液仍呈均匀混浊状（阴性）。 【注意事项】
（1）伤寒杆菌为肠道致病菌，在实验中务必严格无菌操作，遵守实验规则，用后的载玻片应立即投入指定的容器中，接种环必须做灭菌处理。
（2）取细菌培养物时，不宜过多，与抗血清混合涂抹时，必须将细菌涂散，涂均匀，但不宜涂得太宽，以免很快干涸而影响结果观察。 二、人类ABO 血型鉴定试验（玻片法） 1.原理
人类ABO血型抗原有A和B两种。A型红细胞膜上有A抗原，B型红细胞上有B抗原，AB型有A和B两种抗原，而O型则不含有A和B抗原。据此，如分别将抗A和抗B血清与待测红细胞混合，抗A和／或抗B血清与红细胞表面上的相应抗原结合而引起红细胞凝集，根据其凝集状况便可判定受试者的血型（见表5-1）。
表5-1 血型鉴定试验结果与判定
2.方法
（1）用酒精棉球消毒无名指指端皮肤或耳垂，待酒精干后用无菌采血针刺破表皮，用毛细吸管取血1～2滴，放入含1m1 生理盐水的小试管中，混匀，即成待检红细胞悬液(约2％)。取血后，应立即用无菌干棉球压迫针眼止血。
（2）取凹玻片或载玻片一张，用记号笔分为两格，并注明A、B字样。
（3）用巴氏吸管吸取抗A血清、抗B血清各一滴分别滴于A、B格内（也可用2ml的一次性注射器代替巴氏吸管）。
（4）另用巴氏吸管取待测5%红细胞悬液，于A格和B格内各加一滴。然后分别用牙签将抗血清与红细胞搅拌均匀(也可轻轻晃动载玻片以促其充分混匀)，以加速其反应。将玻片放置于实验台上静置数分钟后，在白色背景下观察凝集情况。 3.结果观察与判定
如混合液由均匀红色混浊状逐渐变为澄清，并出现大小不等的红色凝集块者即为红细胞凝集；若混合液仍呈均匀混浊状，则表明红细胞未发生凝集。 如肉眼观察不够清楚，可将玻片置于显微镜下用低倍镜观察。
不凝集（-） 凝集（+）
4.注意事项
（1）试验用凹玻片或载玻片要清洁，注明A 和B 字佯。
（2）所用抗A、抗B血清必须在有效期内(注意试剂包装说明的有效期限)使用。 （3）待检红细胞悬液不宜过稀或过浓。
（4）要及时观察结果，以防时间过长使标本干涸而影响结果观察和判定。 三、试管凝集反应 1.原理
试管凝集反应是一种定量试验，常用已知颗粒性抗原来检测未知抗体及其含量。方法是用生理盐水将待测血清在试管中进行连续倍比稀释，然后于各管中加入等量已知抗原悬液，37℃过夜或56℃水浴2小时后，观察有无凝集并根据凝集程度，判定待检血清抗体的效价。 本法主要用于某些传染病的辅助诊断及流行病学调查，如伤寒、副伤寒及布氏杆菌病的诊断等。 2.方法
（1）取洁净小试管8只并依次排列于试管架上，用特种铅笔或记号笔按顺序注明号码。
（2）将1ml刻度吸管套上乳胶皮头，吸取生理盐水0.9ml 加至1号试管，余下每管中分别加入0.5ml 生理盐水。
（3）用1ml刻度吸管取0.1ml抗伤寒杆菌“Ｈ”血清于第1管中。
（4）用1ml吸管在1号管内连续吸吹三次，使血清与生理盐水充分混匀，然后吸取0.5ml加至2号试管，随后按上法进行倍比稀释直至7号试管，最后从7号管中吸出0.5ml混合液弃去。至此，1～7号试管的血清稀释度依次为1:10，1:20，1:40，1:80，1:160，1:320，1:640，而8号管中只有0.5ml生理盐水，此管系阴性对照管（见图5-1）。
（5）取5ml吸管吸取伤寒杆菌H菌液，加于1～8号试管中，各加0.5ml。此时，每支试管中的液体量均为1ml，1～7号试管的血清最终稀释度分别为1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280。
（6）持试管架轻轻振荡摇匀，以使血清与菌液混合均匀。然后置37℃恒温箱过夜或56℃水浴箱2h，再观察结果。
图5—1 血清等倍稀释法图示
3.结果与判定
（1）对照管（第8管）：上清液混浊，管底有沉淀的物，如斜置试管可见其流动，若轻轻振荡便分散呈混浊状。
（2）试验管：按 1-7号管依次观察。如有凝集（此为阳性），可见管底有凝集块，平铺于试管底部，边缘向上卷曲或出现凝结颗粒，轻摇即升起，“H”菌液的凝集块呈絮状，液体上部澄清。阴性者则与对照管（第8管）相同。 （3）凝集强弱的判定与记录。
++++：表示细菌全部凝集。试管底部有大量凝集块，上清液澄清透明。 +++： 表示绝大部分细菌凝集，凝集物较多或与++++相当，上清液澄清。 ++：表示部分(约50％)细菌发生凝集，凝集物较少，呈颗粒状，上清液基本澄清。 +：凝集物很少，需仔细观察才能发现，上清液基本浑浊。 -：表示不凝集。与阴性对照管相同。
（4）判定凝集效价(滴度)：以凝集物明显可见，且血清稀释度又最高的那一号试管的血清最终稀释度为血清效价。 4.注意事项
（1）实验操作应认真仔细，如向试管内插放吸管宜轻，以免戳穿试管底；取货加样应准确；稀释血清时应仔细地逐管进行，以防跳管。
（2）观察结果时，最好不要振摇试管，以免凝集物摇散振碎而影响他人观察。 四、间接凝集试验 1.原理
本实验是将已知的可溶性抗原吸附或偶联在与免疫无关，有一定大小的颗粒性物质（载体颗粒）表面上，然后再与相应抗体混合，并在有适当电解质存在的条件下，由抗原抗体的特异性结合而发生肉眼可见的载体颗粒凝集。该实验可用于细菌、病毒、钩体、梅毒螺旋体抗体，以及某些自身抗体（如抗核抗体、抗肾抗体、抗甲状腺抗体等0的检测。
可用作载体的物质有红细胞（如Rh-O型血红细胞、绵羊红细胞、兔红细胞等）、聚苯乙烯乳胶颗粒，活性炭以及硅酸铝颗粒等。若所用载体为红细胞，即称间接血凝实验，如载体为乳胶颗粒，则叫间接乳胶凝集试验（见后述）。 2.方法（类风湿因子测定）
（1）用生理盐水将待测血清稀释1:20。
（2）用巴氏吸管吸取1:20待测病人血清一滴于载玻片上，然后加一滴类风湿免疫诊断试剂。 （3）持玻片轻轻晃动使之充分混匀。5分钟内出现均匀的乳白色凝集颗粒者为阳性，无凝集者为阴性。 3.注意事项
应在5分钟内观察结果。因放置过久可出现假阳性。 五、间接乳胶凝集抑制试验 1.原理
将待测样品与已知抗体混合作用一定时间后，再将其与相应抗原致敏的乳胶颗粒混合。如待测样品中含有相应抗原，便可与加入的抗体结合，当再加入致敏乳胶颗粒后，就没有相应的抗体与乳胶颗粒表面的抗原结合而发生凝集，这就是乳胶凝集抑制试验（如图5-2）。所以，不发生凝集者为阳性，表明待测样品中含有相应抗原；发生凝集者为阴性，提示待测样品中无相应抗原。
图5-2 间接凝集抑制试验
本法主要用于检测抗原。如乳胶妊娠试验，就是先将待测孕妇尿液（含有人绒毛膜促性腺激素，HCG)与已知抗HCG抗体作用，从而抑制了抗HCG与致敏乳胶颗粒表面上的HCG结合，于是乳胶凝集被抑制。 2.方法（见表5-2）
（1）取凹玻片一张置实验台上，用标记笔划线分为三格，并注明甲、乙、丙。
（2）用巴氏吸管取生理盐水一滴加入乙格中，然后取待测孕妇尿一滴加在甲格中，另用巴氏吸管取HCG阳性孕妇尿一滴加在丙格中。
（3）于甲、乙、丙格中各加入一滴兔抗HCG血清。分别用牙签将反应液充分搅拌均匀，静置30秒至1分钟。
（4）于甲、乙、丙格中各加入一滴HCG致敏乳胶试剂，分别搅拌均匀。静置10分钟左右后观察结果。
表5-2 乳胶妊娠试验程序
3.注意事项
（1）所用诊断试剂必须是有效期内。用前应充分摇匀。 （2）拌搅用的牙签不能共用。
（3）加样不宜过多，玻片应平置，以防两格之间反应液溢流相混。 （4）如肉眼观察不够清楚，可借助放大镜观察。 【实验报告与思考】
1.记录玻片凝集实验的材料、方法、结果（最好用文字加图示），并讨论。 2.记录血型鉴定试验的材料、方法与结果。
3.记录试管凝集试验的材料、方法、结果及测定效价（可用表格方式表示）。 4. 记录类风湿因子乳胶凝集试验的材料、方法与结果。试对结果作讨论分析。 5.记录乳胶妊娠试验的材料、方法、结果及判定。试验结果予以分析讨论。 6.玻片凝集试验与试管凝集试验有何区别？直接凝集试验与间接凝集试验有何不同？ 【BioRike博瑞克官网】http://www.biorike.com
实验五 凝集反应—医学免疫学实验指导
