呼吸道合胞病毒的检测方法

呼吸道合胞病毒的检测方法

曾军荣综述，李榕娇审校(广东省从化市中心医院检验科 510900)

【摘 要】@@ 呼吸道合胞病毒(RSV)是引起冬春季婴幼儿下呼吸道感染最常见、最重要的病原体之一,约50%的婴儿肺炎和90%的婴儿支气管炎均是因感染RSV所致;最新的研究发现免疫功能缺陷的成年人及老年人也是RSV的易感人群[1-2].目前尚无有效的RSV疫苗面世.因此,快速、准确的RSV检测技术不仅对监测与控制RSV流行具有十分重要的意义,而且能为临床早期诊断提供可靠的实验室依据,也是合理选择治疗方案的基础[3].了解呼吸道合胞病毒检测手段和开展快速病毒检测,已成为当务之急.本文就RSV的检测方法作一简要综述. 【期刊名称】检验医学与临床 【年(卷),期】2011(008)011 【总页数】4

【关键词】【关键词】 呼吸道合胞病毒; 呼吸道感染; 检测方法

呼吸道合胞病毒(RSV)是引起冬春季婴幼儿下呼吸道感染最常见、最重要的病原体之一，约50%的婴儿肺炎和90%的婴儿支气管炎均是因感染RSV所致;最新的研究发现免疫功能缺陷的成年人及老年人也是RSV的易感人群[1-2]。目前尚无有效的RSV疫苗面世。因此，快速、准确的RSV检测技术不仅对监测与控制RSV流行具有十分重要的意义，而且能为临床早期诊断提供可靠的实验室依据，也是合理选择治疗方案的基础[3]。了解呼吸道合胞病毒检测手段和开展快速病毒检测，已成为当务之急。本文就RSV的检测方法作一简要综述。

1 呼吸道合胞病毒的检测方法[4-11]

检测呼吸道合胞病毒感染，目前国内外多采用病毒分离培养法、间接免疫荧光

法(IF)、直接免疫荧光法、碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶桥联酶标法(APAAP)、生物素-链霉亲和素-过氧化物酶法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、病毒快速检测法、分子生物学法，如多重逆转录聚合酶链反应(mRT-PCR)、巢式PCR及核酸杂交、多重实时PCR、基因芯片技术、悬浮阵列技术等多种检测手段。

1.1 APAAP法 用负压吸取鼻咽深部或下方的分泌物0.5～1.0 mL，采用系列呼吸道病毒单克隆抗体桥联酶标诊断试剂盒。用特异性的单克隆抗体(McAb)来测定鼻咽部分泌物脱落细胞中的未知抗原，制片后即可在普通光学显微镜下观察。它所用设备简单，操作简单又快速，特异性强、在普通的光学显微镜下容易辨认，整个操作过程只需3～4 h即可完成。有报道APAAP法与IF法的阳性率接近，敏感度及特异度也接近。

1.2 IF 取患儿的鼻咽洗液，将鼻咽洗液中脱落细胞涂片后，用丙酮固定，一抗和二抗染色后，于荧光显微镜下观察结果。IF法敏感性及特异性均较高，但因其需要昂贵的荧光显微镜，限制了它在基层医院中推广。此外其还有标本不易保存的缺点。

1.3 病毒分离 鼻咽分泌物经常规处理后，接种Hep-2和MDCK细胞，在含有2%牛血清的MEN培养基中生长，33℃旋转培养，连续观察细胞变化，有特征性病变出现者，确定为阳性;若盲传3代，如仍无病变出现，确定为阴性。该法特异性较强，但其费时长，一般需1～2周才能观察到病变，且成本较高，病毒分离阳性率低[12]。

1.4 mRT-PCR[13] 采用经过Hep-2细胞接种培养的RSV A、B型标准毒株病毒液和MDCK细胞接种培养的FluA3、FluB以及FLuA1.3、FLuB和RSV A、B型混合毒株病毒液，并使用5组引物，经mRT-PCR于紫外灯下观察上述病

毒特异核苷酸琼脂糖凝胶电泳条带。不同呼吸道病毒mRT-PCR产物经3%琼脂糖凝胶电泳后其DNA条带的位置明显不同，易于区分并且在较高的稀释度仍可见清晰条带;根据DNA条带位置还可以准确鉴定病毒的种类、型和亚型;mRT-PCR是体外特异DNA扩增法，该方法的最大优点是敏感、特异、快速，并可使某些不能培养或难以培养的病毒得以检测;但此方法不能区别有感染毒力的病毒和死病毒，因此目前尚不能放弃传统的细胞分离培养。

1.5 巢式PCR和核酸杂交 取鼻咽分泌物用Hank′s液吹打混匀，离心吸取上清液，收集沉淀，作为待检标本。巢式PCR取上清液，经第1次、第2次PCR扩增，扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，观察特异性条带。核酸杂交取沉淀液根据DIG-d、UTP及DIG核酸检测试剂盒说明进行亚型特异性探针的制备及核酸检测，有显色的标本确定为阳性。能快速、特异地检测临床标本中的RSV，并对RSV阳性标本进行分型，方法快速简易，成本较低。巢式PCR灵敏度高，其RSV阳性率高达82.5%，选择部分阳性标本进一步进行杂交证实无假阳性。 1.6 多重实时PCR 实时定量PCR具有快速检测、减少污染、准确定量、灵敏度高和特异性强的优点，多重PCR可同时检测多种病毒病原，而两者相结合的多重实时定量PCR结合了两者的优点，更由于减少酶和荧光染料或探针的使用量，降低了检测成本[14]。

1.7 基因芯片技术 近十几年来，分子生物学方法，特别是基于PCR技术的检测方法在病毒检测领域得到迅猛发展，成为病毒检测的一项革命性技术。PCR技术检测方法不仅速度快，灵敏度高，而且有时可以同时检测数种病毒。然而，这些技术都还存在一些无法弥补的缺陷。近几年来，基因芯片技术用于临床研究日趋增多，特别是用于诊断一些微生物病原体的感染。与传统的分子生物学