cell转染

细胞转染技术简介 转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。 理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难 普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。 本公司生产的高效转染试剂VigoFect，是一种以阳离子非脂性物质为主的配方组分，该类物质介导的细胞转染，是目前非病毒转染方法中转染效率最高的方法。VigoFect使用方便，转染效率高，对细胞毒性小，并有广谱的转染特性。在许多实验室长期使用，获得了优异的效果。一些实验室用VigoFect进行SiRNA的转染，也获得满意的结果。 需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。 细胞传代 (1) 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒(以上物品均需高压灭菌)，酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。 (2) 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。 (3) 用Tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟(37。C，5%CO2 )。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。 (4) 加入1ml的含血清培养基终止反应。 (5) 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。 (6) 将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。 (7) 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。 (8) 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。 (9) 将培养皿转入CO2培养箱中培养，第二天转染。 细胞转染 1)转染试剂的准备 A. 将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。 B.震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡，。 2) 选择合适的混合比例(1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量)来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。 5) 将混合液在室温放置10—15分钟。 6) 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。 7) 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。 8) 到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。 第二次细胞传代 1) 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。 2) 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X105个细胞/35mm培养皿将细胞重新粉入培养皿中。 3) 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。 转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。一些传统的转染技术，如DEAE右旋糖苷法，磷酸钙法，电穿孔法，脂质体法各有利弊，其主要原理及应用特点见下表： 转染方法 原理 磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞 带正电的DEAE-右旋糖苷与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞 应用 特点 稳定转染不适用于原代细胞操作简瞬时性转便但重复性差有些细胞不染 瞬时性转染 适用 相对简便、结果可重复但对细胞有一定的毒副作用转染时需除血清 磷酸钙法 DEAE-右旋糖苷法 稳定转染适用性广但细胞致死率电穿孔法 高脉冲电压破坏细胞膜电位，瞬时性转高，DNA和细胞用量大， DNA通过膜上形成的小孔导入 染所有细需根据不同细胞类型优化胞 病毒介导法 通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中 电穿孔实验条件 可用于难转染的细胞、原稳定转染 代细胞，体内细胞等 特定宿主细胞 但携带基因不能太大细胞需处分裂期需考虑安全因素 逆转录病毒 腺病毒 通过侵染宿主细胞将外源基因瞬时转染可用于难转染的细胞需考整合到染色体中 特定宿主虑安全因素