8.蛋白酶（酸性、中性、碱性）的特征与相应的发酵微生物菌。
答：中性蛋白酶生产菌枯草杆菌1.398,S114,172,放线菌166，栖土曲霉3.942； 碱性蛋白酶生产菌地衣芽孢杆菌2709，短小芽孢杆菌289，209；
酸性蛋白酶生产菌黑曲霉3.350，宇佐美曲霉537，肉桂色曲霉No.81，浆油工业用的米曲霉3042。 按酶的最适pH分类：
①酸性蛋白酶，最适pH2.0-5.0。 ②中性蛋白酶，pH7-8。
③碱性蛋白酶，pH9.5-10.5。
为方便起见，微生物蛋白酶常用此分类法。
酸性蛋白酶主要来源于哺乳动物的消化道, 如胃蛋白酶; 部分微生物是酸性蛋白酶的主要来源, 如:目前的商品酸性蛋白酶制剂主要是由黑曲霉发酵生产
分子特性: 酸性蛋白酶的最适pH在2-5范围, 酶蛋白的等电点在pI3-5, 分子量MW30,000-35,000。
② 催化特性: 酸性蛋白酶的最适温度因来源不同而有差异, 一般霉菌的蛋白酶的最适温度较高, 大部分在50-60℃范围, 而来源于动物胃粘膜的蛋白酶的最适温度较低, 一般在40℃左右, 但酸性蛋白酶的热稳定性都较差, 一般在50℃都很快失活, 此外, 酶的热稳定性还受到基质的pH的影响; 有些酸性蛋白酶不耐低温, 在低温条件下,很快失活。许多酸性蛋白酶分子中含5-10%多糖，对酶的稳定有益。
中性蛋白酶是最早用于酶制剂工业化生产的蛋白酶, 目前的微生物生产的商品酶制剂的菌种主要有: 枯草杆菌、耐热解蛋白芽孢杆菌、灰色链霉菌、寄生曲霉、米曲霉、栖土曲霉。
除上述微生物生产中性蛋白酶外, 来源于植物的木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶等都属于中性蛋白酶。
① 分子特性: 大部分微生物产生的中性蛋白酶属于金属蛋白酶, 一分子酶蛋白含有一个锌原子, 酶蛋白的分子量在35,000-40,000范围, 等电点pI 8-9, 微生物蛋白酶中, 中性蛋白酶的稳定性最差, 分子之间最容易发生自溶, 即使在低温条件下, 也会发生明显的自溶, 造成分子量明显降低。
② 催化特性: 中性蛋白酶的热稳定性较差, 如 枯草杆菌的中性蛋白酶在pH7, 60℃处理15min, 失活90%; 栖土曲霉的中性蛋白酶在pH7, 55℃处理10min, 失活80%以上; 以酪蛋白为底物时, 枯草杆菌蛋白酶的最适pH7-8、热解蛋白芽孢杆菌的中性蛋白酶的最适pH7-9、栖土曲霉的中性蛋白酶pH6.5-7.5; 最适温度受测定时的反应时间有直接关系, 因为酶蛋白的稳定性较差, 所以反应时间的长短影响着反应结果, 一般在10-30min 最适温度为45-50℃。钙离子可以增加酶蛋白的稳定性,并减少自溶。
碱性蛋白酶主要是由微生物产生, 微生物中主要是细菌的部分菌种产生碱性蛋白酶, 目前碱性蛋白酶主要是用于洗涤剂、皮革工业、丝绸脱胶。
几乎所有的细菌碱性蛋白酶都是胞外蛋白酶, 主要包括两类: 其一是在中性条件下生产的碱性蛋白酶, 如枯草杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌等; 其二是嗜碱微生物, 其必须在碱性条件下[pH8-10]才能生产的碱性蛋白酶。
① 酶蛋白特性: 碱性蛋白酶的分子量比中性蛋白酶的分子量小, 一般在20,000-34,000Da, 而且等电点较高, 一般在pH8-9。
② 催化特性: 大部分碱性蛋白酶的最适pH在7-11范围, 当以酪蛋白为底物时, 最适pH为9.5-10.5, 碱性蛋白酶除能够水解肽键外, 还具有水解酯键的能力和转肽能力, 最适温度因菌种不同而有差异, 一般在50 ℃左右, 酶蛋白的热稳定性不高, 50-60℃处理15分钟, 几乎有50%的酶活力丧失, 我国目前生产的几种碱性蛋白酶的热稳定性一般都在60℃以下。
中性蛋白酶——枯草芽胞杆菌、栖土曲霉、灰色链霉菌、放线菌等 碱性蛋白酶——地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌等
酸性蛋白酶——大都采用曲霉
中性蛋白酶作为一种内切蛋白酶，具有纯天然、安全无毒、水解能力强、作用范围广等。2、中性蛋白酶应用于焙烤，可降低面团湿筋度、改良面团可塑性及理化性质，同时使蛋白质大分子水解成短肽和氨基酸，从而有利于糖类和氨基
类物质进行复杂的美拉德反应。3、中性蛋白酶通过采用生物工程技术,微滤、超滤膜分离及真空冷冻干燥技术，产品质量达到食品级和医药级的质量标准。最适温度：50℃。最适pH：7.0
碱性蛋白酶是由造育的地衣芽孢杆菌发酵而得，主要成分为枯草杆菌蛋白酶，是一种内切酶，催化部位为丝氨酸，分子量约为27300.底物浓度10~25%，温度50~60℃，PH值6.0~8.5，反应时间3~6小时（根据要求可长可短）添加酶0.03~0.06%（以水解溶液重量计)
和氏璧酸性蛋白酶是由黑曲霉经受控发酵过程获得，它能在pH值为酸性的条件下水解蛋白质为氨基酸和多肽。其使用于酒精、白酒、果酒、啤酒、黄油以及酱油的生产，可澄清发酵醪液和成熟醪液。增强酵母生长，得到更快的发酵速度，更高的产品收率。在啤酒生产中应用，还能有效阻断双乙酰生成，缩短啤酒成熟期。本产品符合食品添加剂要求使用温度为10℃~55℃，最佳50°C, pH为2.5~6.0，最佳3.5 9.关于纤维素酶。 纤维素酶
纤维素酶是具有纤维素降解能力酶的总称。
能利用晶体纤维素的微生物都能或多或少地分泌纤维素酶。 纤维素酶主要来自真菌和细菌，真菌的纤维素酶产量较高。
纤维素分子是由葡萄糖残基以β-1,4-糖苷键连接组成的不分支的直链葡聚糖，是植物中最广泛存在的骨架多糖，构成植物细胞壁的结构。
1.葡聚糖内切酶：能在纤维素分子内部任意断裂β-1,4（CX酶） 糖苷键,产生大量非还原末端的小分子纤维素。（E.C 3.2.1.4）
2.葡聚糖外切酶或纤维二糖酶：能从纤维分子的非还原端依（C1酶） 次裂解β-1,4糖苷键释放出纤维二糖分子。（E.C 3.2.1.91）
3.β-葡萄糖苷酶：能将纤维二糖及其他低分子纤维糊精分解为葡萄糖。（E.C 3.2.1.21） 提高纤维素酶降解纤维素效率的研究主要包括 ： 通过筛选产酶菌种和培养条件，寻找高活性纤维素酶；
采用各种方法处理纤维素，使其更易于分解，如：物理法（爆破法、机械法)、化学法(酸或碱处理法)、生物法等；
筛选酶解工艺条件：温度50、pH值4-5，酶促反应时间，激活剂等。 8.作业：Mg2+、K+、NH4+、Fe2+、Mn2+在柠檬酸合成中各起什么作用？ a.黑曲霉的磷酸果糖激酶（PFK）是一种调节酶;
b.AMP、无机磷和NH4+ 对PFK有活化作用;NH4+ 还能解除柠檬酸和ATP对此酶的抑制，即细胞内NH4 + 浓度升高使PFK对细胞内积累的大量柠檬酸不敏感；
c.NH4+升高的原因：Mn2+ 缺乏至使蛋白质和核酸合成受阻，NH4+异常升高，致使丙酮酸和草酰乙酸水平升高，并减少柠檬酸对PFK的抑制；
d.黑曲霉的丙酮酸羧化酶是组成型，不被乙酰-CoA抑制，从而维持了丙酮酸生成乙酰CoA和草酰乙酸这两个物质的平衡。
3.Mn2+的效应是通过NH4+水平升高而减少柠檬酸对PFK的抑制，NH4+ 水平升高是因为Mn2+ 缺乏使HMP和TCA循环的酶水平降低，生长菌体的蛋白质和核酸合成受阻。生物素对谷氨酸代谢和天冬氨酸代谢的影响机理。
葡萄糖经糖酵解(EMP途径)和己糖磷酸支路(HMP途径)生成丙酮酸，再氧化成乙酰辅酶A(乙酰CoA)，然后进入三羧酸循环，生成α-酮戊二酸。α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化及有NH4+存在的条件下，生成谷氨酸。
当生物素缺乏时，菌种生长十分缓慢；当生物素过量时，则转为乳酸发酵（讨论）。因此，一般将生物素控制在亚适量条件下，才能得到高产量的谷氨酸。
提示：谷氨酸在细胞内的积累和释放到细胞外，并非细菌的正常生理现象。
在微生物的代谢中，Glu比Asp优先合成；合成过量时则抑制谷氨酸脱氢酶，使代谢转向合成Asp；Asp过量时反馈抑制PEP羧化酶的活力，停止合成草酰乙酸。
说明：NH4+的导入不仅仅证明Glu是氮素同化发酵，它还会抑制Glu生成的逆反应，因此当NH4+存在时，葡萄糖的消耗速度很快，Glu的生成很高；但是当生物素充足时，NH4+几乎不影响糖代谢。 4.谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌代谢调节天冬氨酸族氨基酸的特点。
在黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌等微生物中，AK是单一的，并且受Lys 和 Thr的协同反馈抑制，反馈调节易于解除，使育种简单化，所以常常被用作氨基酸发酵育种的出发菌株。 （3）苏氨酸高产菌株具备的特征；
切断支路代谢，选育Met－、Lys－、Ile－的突变株；
选育抗Thr和Lys结构类似物的突变株，遗传性的解除Thr对高丝氨酸脱氢酶的反馈调节，以及Thr、Lys对天冬氨酸激酶的协同反馈抑制； 增强Asp的生物合成
（4）赖氨酸高产菌株具备的特征； 1）切断或减弱支路代谢，选育高丝氨酸缺陷型（Hom－）突变株，或蛋氨酸和苏氨酸或异亮氨酸缺陷型（Met－ + Thr－、Ile－）突变株；
2）解除Thr和Lys的协同反馈抑制作用，选育结构类似物抗性突变株，使赖氨酸大量积累，如： ①S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸抗性株（AECr） ②L-赖氨酸氧肟酸盐抗性株（LysHxr）
③苏氨酸氧肟酸盐抗性突变株（ThrHxr）等；
3）增加Lys前体物Asp的量：切断生成丙酮酸的支路，同时解除Asp对PEP羧化酶（即PC）的反馈抑制；选育丙氨酸缺陷型（Ala－）或温度敏感突变株（tmps），中断丙酮酸到Ala的反应；选育AspHxr、磺胺类药物抗性突变株；
4）在乳糖发酵短杆菌中，Lys的生物合成与亮氨酸（Leu）之 间存在着“代谢互锁”，即赖氨酸分支途径的初始酶二氢吡 啶-2,6-二羧酸（DDP）合成酶受Leu的反馈阻遏（如图 为解除代谢互锁，可选育：⑴ 选择亮氨酸缺陷型菌株； ⑵ 选育抗亮氨酸结构类似物突变株；
⑶ 选育对苯醌或喹啉衍生物敏感株——这是一种寻找亮氨酸渗漏缺陷型菌株的育种方法。 增加前体物的合成和阻塞副产物生成:⑴ 选择丙氨酸缺陷型菌株；⑵ 选育抗天冬氨酸结构类似物突变株；⑶ 选育适宜的CO2固定酶/TCA循环酶活性比的菌株
选育温度敏感突变株：如，乳糖发酵短杆菌 AJ11093 AJ1099 在发酵前期于29～33℃生长良好，而到34 ℃以上时则不能生长，发酵积累赖氨酸盐酸盐。 添加丰富的生物素，既可以使Glu不排出体外，并使代谢 流转向Lys的合成，又能提高PEP羧化酶（ PC ）的活性，促使PEP生成草酰乙酸，再生成Asp。
蛋白酶
