利用抗逆指标（非生物胁迫）筛选功能基因及表型验证 产品概述
酵母菌为真核生物，与植物、动物表达系统更为接近，也具有糖基化、二硫键形成以及蛋白质折叠翻译后加工等过程，从而使得筛选出的植物基因所编码的蛋白功能正常发挥，多重逆境抗性基因假阳性的概率大大降低。利用酵母菌，在逆境系统下，检测酵母菌表达可溶性蛋白是否可以帮助酵母菌度过逆境胁迫。通过抗性梯度实验对基因组范围内的抗性相关基因进行筛查，并对筛查的结果进行了生物信息学分析，将这些抗逆基因进行归纳、分类。 技术特点 高通量筛选：酵母高通量抗逆基因筛选服务能够快速筛选岀非模式抗逆物种资源中的多重逆境抗性相关的大量基因，将具有非常重要的意义。
可溶性真核表达：利用蛋白组学寻找候选蛋白，进行蛋白水平上的表型验证。
敏感性酵母菌株：YCF1/BY4741/ InVSCI，是单细胞真核微生物，具有生长迅速，易于遗传操作，可分泌表达外源蛋白等特点，能对外源蛋白进行翻译后的加工和修饰，是表达外源蛋白的合适宿主。
pYES2 载体是为检测重组蛋白在酵母中诱导表达情况而设计的，该载体含有诱导性启动子 GAL，在半乳糖存在情况下，大量诱导外源蛋白表达，而在葡萄糖存在的情况下，抑制外源蛋白表达，且含有ura3 基因，利于对ura3 缺失体宿主菌阳性克隆的筛选。 应用领域
耐药性：药用生物耐药性分子机制研究等 重金属：生物重金属修复机制研究等 抗逆性：生物抗逆性的功能蛋白研究等 服务流程
根据客户要求提供利用酵母快速筛选生物多重逆境抗性基因的项目，根据基因同源重组筛选对各种逆境条件均敏感的酵母突变体，快速筛选出各种动植物材料cDNA文库中对多种逆境都具有抗性的抗逆基因并进行功能表型验证。
逆境材料—RNA提取—酵母表达文库构建--酵母表达文库质量鉴定—酵母工作菌液—逆境条件优化--酵母逆境筛选--酵母阳性克隆鉴定--酵母诱导表达--筛选平板验证--抗逆基因功能性表型验证
文献解析 一、重金属领域
OsNRAMP1 contributes to cadmium and manganese uptake in rice
发表期刊：Plant，Cell＆Environment 影响因子：6.362 合作单位：南京农业大学 发表时间：2020.07 材料
日本晴水稻，酵母菌株SEY6210，锰摄取缺陷型酵母突变体△smf1，铁摄取缺陷双突变体DDY4 研究策略
利用CRISPR/Cas9系统构建了一个以OsNRAMP1载体构建与转基因植物的培育 酵母表达分析
基因表达分析
转基因植物表型分析与数据统计
研究结果
和OsNRAMP5为靶点的双敲除载体并转到水稻中 将构建的质粒或空载体(PYES2)导入野生型酵母菌株SEY6210 OsNRAMP1的亚细胞定位 OsNRAMP1-eGFP免疫组织学染色 用（DAPI）染色定位细胞核 通过水培,土壤盆栽等试验,研究目的基因敲除后对水稻Cd和Mn积累的影响
图1:酵母中OsNRAMP1转运活性的测定 图2:OsNRAMP1蛋白的定位
参考文献
1. ?kesson,A.,Barregardhl,I.A.,Nordberg,G.F.,Nordberg,M.,Skerfving,S.(2014).N
on-renal effects and the risk assessment of environmental cadmium exposure. Enviromental Health Perspective, 122, 431-438.
2. Alejandro, S., Cailliatte, R., Alcon, C., Dirick, L., Domergue, F., Correia, D.,
Castaings, L., Briat, J.F., Mari, S., Curie, C. (2017). Intracellular Distribution of manganese by the trans-Golgi network transporter NRAMP2 is critical for photosynthesis and cellular redox homeostasis. The Plant Cell, 29, 3068-3084.
二、耐药性
Characterization of the Efflux Capability and Substrate Specificity of Aspergillus fumigatus PDR5-like ABC Transporters Expressed in Saccharomyces cerevisiae
发表期刊：mBio 影响因子：6.784 发表时间：2020.03
材料与方法
烟曲霉，酿酒酵母菌株BY4741/W303 研究策略 外排试验
烟曲霉外排，氯炔对唑类药物外排的抑制作用，Ala-Nap外排试验，罗丹明6G外排试验 利用荧光染料罗丹明6G(R-6G)的微量滴度分析烟曲霉菌ABC外排转运体的潜在功能，该微滴定法测量随着 时间的推移R-6G从细胞排入上清液的情况。
烟曲霉菌RNA的提取、转运子选择和cDNA合成
质粒构建 酿酒酵母背景菌株的构建及MIC药敏试验 使用实时逆转录定量PCR（RT-qPCR）将所有临床烟曲霉菌临床分离株基因表达的RT-qPCR检测 分离株中abcA、abcC、abcF、abcG、abcH或abcI的表达水平与三唑敏感菌株DI16-7中的表达水平 进行比较 细胞壁/膜敏感性，重组酿酒酵母菌株的MIC值按照肉汤微量稀释法测定，抗药敏感性系列稀释斑点法 研究结果
图1 氯炔抑制唑类药物的能量依赖性外排 图2 药敏琼脂斑点试验
图3 ALA-NAP流出 图4 罗丹明6G的外排和FK506的抑制作用
参考文献
1. Chamilos G, Kontoyiannis DP. 2005. Update on antifungal drug resistance mechanisms of Aspergillus fumigatus. Drug Resist Updat 8:344 –358. https://doi.org/10.1016/j.drup.2006.01.001. 2. Bellete B, Raberin H, Morel J, Flori P, Hafid J, Manhsung RT. 2010.Acquired resistance to voriconazole and itraconazole in a patient with pulmonary aspergilloma. Med Mycol 48:197–200. https://doi.org/10.3109/13693780902717018.
三、非生物抗逆性领域
A genetic analysis reveals novel histone residues required for transcriptional reprogramming upon stress
发表期刊：Nucleic Acids Res. 影响因子：11.501 发表时间：2020.04
材料
酵母菌株：BY4741，BY4742，Y5563 研究策略
交配建新库 单细胞转录筛查 三维分析/Northern blot RNA测序与分析 酵母斑点试验/生长曲线 蛋白质组学分析
研究结果
设计重组组蛋白肽并表达与纯化/激酶纯化 体外激酶测定:用western blot检测GST融合蛋白和标记激酶 磷酸化蛋白质组学:细胞培养与裂解/磷酸肽富集/高pH分馏磷酸肽 高pH分馏采用内部包装的C18微柱。 LC-MS/MS测量：LC-MS/MS实验使用一个终极3000 RSLCnano系统与Fusion Lumos Tribrid质谱仪耦合进行。 肽和蛋白质鉴定:染色质免疫沉淀法 激酶-LexA系链 酵母菌株在96孔板上生长，并经受热应激（39°C）或渗透胁迫（0.4 M NaCl）45分钟，采用荧光流式细胞术?对胁迫诱导的表达进行定量。 酵母菌株在丰富的培养基中培养到对数中期，然后对H4-S47野生型和H4-S47D菌株施加渗透性（15分钟0.4 M NaCl）或对H4-T30野生型、H4-T30A和H4-T30D菌株进行热应激（10分钟39°C）。每种情况下进行三次生物重复,采用标准热酚法和玻璃珠法提取总RNA。 将野生型和所指示的组蛋白突变株在琼脂YPD平板上进行连续稀释让细胞在30℃（渗透胁迫）或39℃（热胁迫）下生长3-5天,绘制生长曲线和斑点图。
图4 H4-S47D拟磷酸突变体在渗透胁迫下表现出转录和生长缺陷
图7突变体H0D在模拟热胁迫下的生长反应
参考文献
1. de Nadal,E., Ammerer,G. and Posas,F . (2011) Controlling gene expression in response to stress. Nat. Rev. Genet., 12, 833–845.
2. Saito,H. and Posas,F . (2012) Response to hyperosmotic stress. Genetics, 192, 289–318.
南京瑞源生物技术有限公司坐落于南京市栖霞区生命科技园，专注于基因组高通量研究领域，致力于生物高科技研发，目前产品的技术水平已达到省级实验水平，瑞源生物立足于生命科学，为基础研究领域科学工作者提供生物学技术服务，自2019年创立以来，全体员工致力于利用酵母系统研发新药物靶点，专注于生物学研究，长期与全国各大农林/医药院校在大型科研技术研发上紧密合作。
高通量抗逆基因筛选及功能验证宣传册
