第三章 发酵工业微生物菌种 微生物发酵工业是利用微生物的生长和代谢活动生产各种有用物质的现代工业，它是以培养微生物进行发酵为主。而在这个过程中，优良的菌种是一个现代化的发酵工业必不可少的，最为重要的环节。其他如先进的生产工艺和先进的设备，则是为了更充分发挥优良菌种的性能而设计的。
第一节 工业微生物菌种的分离和选育 第二节 工业微生物菌种的改良 第三节 发酵工业中菌种的退化 第四节 工业微生物菌种的保藏 第五节 工业微生物菌种的扩大培养
第一节 工业微生物菌种的分离和选育
一般来说，从自然界直接分离到的菌种，不能立即适应实际的生产需要，只有通过选育，才能提高代谢产物的产量、改进产品质量直至简化工艺。在微生物发酵工业中生产菌种的选育方法有：
? 微生物菌种的分离和选育 ? 菌种的改良
第一节 工业微生物菌种的分离和选育 一、微生物菌种的选育 二、微生物常规育种
三、根据代谢的调节机理选择高产突变菌株
一、微生物菌种的选育
从自然界分离新菌种一般包括以下几个步骤： 1、采样
2、增殖培养 3、纯种分离 4、性能测定
1、采样
采样地点的确定要根据筛选的目的、微生物的分布概况及菌种的主要特征与外界环境关系等，进行综合、具体地分析来决定。如果不了解某种生产菌的具体来源，一般可以从土壤中分离。 ①、确定选好地点
取离地面5——15cm处的土壤几十克，盛入预先消毒好的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，记录采样时间、地点、环境情况等，以备查考。 ②、尽快分离
一般土壤中芽孢杆菌、放线菌和霉菌孢子忍耐不良环境能力较强，不太容易死亡。但一般应尽快分离。
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③、酵母菌或霉菌类微生物采样
酵母菌或霉菌类微生物，它们对碳水化合物的需要量比较多，一般又喜欢偏酸环境，所以在普通植物花朵、瓜果种子及腐植质等上面比较多。
2、增殖培养
收集到的样品，如含有所需的菌种较多，可直接进行分离。如果样品含有所需要的菌种很少，就要设法增加该菌种的数量，进行增殖（富集）培养。 富集培养：
富集培养就是指利用不同微生物之间的生命活动特点的不同，制定出特定的环境条件，使仅仅适应于这种条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加的微生物的分离方法。人们能够利用这种方法很容易地从自然界中分离到所需要的特定微生物。富集的条件可根据所需分离的微生物特点从物理、化学、生物及综合多个方面进行选择，如温度、紫外线、高压、光照、氧气、营养等许多方面。
3、纯种分离
通过增殖培养还不能得到微生物单一的纯种，有必要进行分离纯化，来获得纯种。 这是因为生产菌种在自然条件下通常是与各种菌混杂在一起的。
纯种的分离方法很多，常用的有划线法和稀释法。 ①、 划线法
①、划线法——是将含有菌样的样品在固体培养基表面作有规则的划线培养。
? 扇形划线法、 ? 方格划线法 ? 平行划线法等
菌样经过多次从点到线的稀释，最后经培养得到单菌落。 ②、 稀释法。
是通过不断地稀释使被分离的样品分散到最低限度，然后吸取一定量注入平板，使每一微生物都远离其他微生物而单独生长成为菌落，从而得到纯种
③、两种方法的比较 ③、两种方法的比较
? 划线法简单较快；
? 稀释法在培养基上分离的菌落单一均匀，获得纯种的机率大，特别适宜于分离具有蔓延性的
微生物。
为了提高筛选的工作效率，除增殖培养时应控制增殖条件外，在纯种分离时，培养条件对筛选结果影响也很大，一般可通过：
? 控制营养成分 ? 调节培养基PH ? 添加抑制剂
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? 改变培养温度 ? 通气条件
? 热处理等来提高筛选效率。 4、生产性能的测定
①、初筛 ②、复筛
——由于纯种分离后，得到的菌株数量非常大，如果对每一菌株都作全面或精确的性能测定，工作量就特别繁杂。因此可适当简化，一般采用两步法
经过多次重复筛选，直至获得1——3株较好的菌株，供发酵条件的摸索和生产试验，进而作为育种的出发菌株。
这种直接从自然界分离得到的菌株称为野生型菌株。以区别于用人工育种方法得到的变异菌株。
一、微生物菌种的选育 二、微生物常规育种
三、根据代谢的调节机理选择高产突变菌株
二、微生物常规育种 一）、微生物诱变育种的机理 1、突变的概念
2、诱变育种的主要环节 3、诱变育种的优缺点
1、突变的概念——微生物中可遗传的特性发生的变化称为变异，也叫突变。这种突变是微生物产生变种的根源，同时也是育种的基础。根据突变发生的原因可以分为
1）、自然突变——自然突变是指在自然条件下出现的基因突变。 2）、诱发突变——诱发突变是指用各种物理和化学因素人为地使诱变对象细胞内的遗传物质发生变化。人工诱变能提高突变频率和扩大变异谱，它的缺点则是缺乏定向性。 2、诱变育种的主要环节
①、处理悬浮液
用合适的诱变剂处理大量而分散的微生物细胞悬浮液（细胞或孢子），在引起绝大多数的细胞致死的同时，使存活个体中DNA结构变异频率大幅度提高；
②、选育优良菌株
用合适的方法淘汰负效应变异株，选出极少数性能较优良的正变异株，以达到培育优良菌株的目的。
3、诱变育种的优缺点 1）、优点
（1）、菌种的特性方面
①、提高菌株的生产能力； ②、 改进产品的质量；
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③、 扩大品种； ④、 简化工艺。
（2）、育种的方法方面
①、速度快； ②、收效显著； ③、方法简便
由于上述特点，在育种工作和生产实践中都得到了广泛的应用。 目前，发酵工业中的生产菌，绝大部分都是经过诱变的改良菌种。
2）、缺点
①、诱变育种缺乏定向性； ②、工作量大；
③、诱变因素对某些菌种的作用不明显；
④、对已是高产菌株进一步要提高产量仍较困难。 三）、诱变育种程序的要点
1、出发菌株的选择
①、从自然界分离得到野生型菌株；
②、通过生产选育的菌株； (即由自发突变经筛选得到的菌株) ③、已经诱变过的菌株。 (这类菌株作为出发菌株较为复杂)
2、菌悬液制备要求
①、一般采用生理状态一致的单细胞或 孢子进行诱变处理； （用选择法或诱导法使微生物同步生长）
②、一般处理细菌的营养细胞；(采用生长旺盛的对数期，变异率较高而且重现性好) ③、一般处理霉菌的孢子悬浮液；(因为霉菌的菌株往往是多核) ④、一般处理刚刚成熟时的放线菌孢子 (此时的变异率比较高)
⑤、细菌和放线菌的处理浓度为108个/ml; 真菌的处理浓度为106个/ml.
3、前培养
一般在诱变处理前，将细胞在添加有嘌呤、嘧啶等碱基的培养基中培养20——60分钟，再进行诱变处理，效果很好。
4、诱变剂的选择
能诱发基因突变并使突变率提高到超过自然突变水平的物理、化学因子都称为诱变剂
? 物理诱变剂 ? 化学诱变剂
①、物理诱变剂——主要有各种射线，如X射线、γ-射线、α－射线、β－射线和超声波等。其中紫外线应用最广。
因为紫外线的光谱正好与细胞内的核酸的吸收光谱相一致，因此在紫外光的作用下，能使DNA
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链断裂、DNA分子内和分子间发生交联，从而导致菌体的遗传性状发生改变。 ②、化学诱变剂——化学诱变剂的种类非常的多，常用的有
? 甲基磺酸乙酯（EMS） ? 亚硝基胍 ? 亚硝酸等
它们作用于微生物细胞后，能够特异地与某些基团起作用，即引起遗传物质的原发性损伤和细胞代谢方式的改变，失去亲株原有的特性。并建立新的性状。
5、变异菌株的分离和筛选
通过诱变处理后，在微生物群体中会出现各种突变型的个体，但其中多数是负突变体。因此要全力选出适合人们需要的优良菌株，一般分为初筛、复筛两个阶段。初筛以量为主，复筛以质为主。
1） 、初筛方法
①、根据形态变异淘汰低产菌株
某些菌落形态与生产性能有直接的相关性，可以在平皿上直接筛选。 如在灰黄霉素生产菌的选育中，菌落暗红色变深者的，产量就提高。由此做为指标性状可以直接筛选。 ②、根据平皿反应直接挑取高产菌株
所谓平皿直接反应就是指每个菌落产生的代谢产物与培养基内的指示物作用后的变色圈或 透明圈等，可以表示菌株的生产活力的高低，因此，可以作为初筛的标志性状。
2）、复筛方法
营养缺陷型的筛选方法 ①、营养缺陷型筛选 ②、淘汰野生型菌株 ③、营养缺陷型菌株检出
几个重要的概念
a、基本培养基 b、完全培养基 c、补充培养基 d、野生型 e、营养缺陷型 f、原养型
a、基本培养基 (MM minmimal medium)
仅能满足某种微生物的野生型菌株生长需要的 最低成分组合培养基，又称为基本培养基。用符号［—］表示。
b、完全培养基 (CM，complete medium)
凡是可以满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基。用符号［+］表示。
c、补充培养基 (SM，supplementa medium)
凡是只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组合培养基。用符号［A］ 或［B］表示。 d、野生型
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第三章 工业发酵菌种
