南方农业学报JournalofSouthernAgriculture2018，49（9）：1841-18489期2095-1191；ISSNCODENNNXAABhttp://www.nfnyxb.com·1841·DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2018.09.23室内培育不同产地卤虫的成虫肠道菌群结构分析
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茹文红1，，段亚飞1，郑晓婷3，董宏标1，刘青松1，张家松1*
（1中国水产科学研究院南海水产研究所/农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室，广州510300；2上海海洋大学
9000）
水产与生命学院，上海201306；3根特大学水产养殖和卤虫研究中心，比利时根特
摘要：【目的】探究室内培育卤虫的成虫肠道菌群组成及结构特征，为开展人工健康养殖卤虫提供参考依据。【方法】选取俄罗斯鄂木斯克地区及我国巴里坤和渤海湾产地的卤虫卵进行孵化，人工养殖至成虫期后采用16SrDNA高通量测序技术分析不同产地卤虫肠道内的菌群组成及结构特征。【结果】IlluminaMiSeq测序共得到481096条有效序列，平均每个样品有53455条有效序列。变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）为不同产地卤虫肠道内的优势菌群，其在肠道菌群内的相对丰度均在97.0%以上。不同产地卤虫肠道菌群的共有OTU为291个，共有OTU对应序列数占不同产地卤虫总序列数的95.04%。其中，假单胞杆菌属（Pseudomonas）有29个OTUs，其对应序列数占总序列数的31.25%；盐单胞杆菌属（Halomonas）有15个OTUs，其对应序列数占总序列数的16.44%；交替赤杆菌属（Altererythrobacter）有9个OTUs，其对应序列数占总序列数的12.00%。不同产地的卤虫肠道菌群也存在一定差异，交替赤杆菌属和列文虎克菌属（Leeuwenhoekiella）在俄罗斯鄂木斯克卤虫肠道内的相对丰度显著高于我国巴里坤和渤海湾产地的卤虫（P<0.05，下同），微小杆菌属（Exiguobacterium）在我国巴里坤卤虫肠道内的相对丰度显著高于俄罗斯鄂木斯克地区和我国渤海湾产地的卤虫，而Idiomarina属仅在我国渤海湾卤虫肠道菌群中出现。【结论】卤虫肠道菌群构成与其生存的水体环境和摄食的饵料相关，因此可通过调整养殖水体环境和投喂饵料的一致性以提高肠道共有菌群的比例。卤虫肠道中参与食物消化吸收的有益菌群可作为今后研究卤虫生长机制的靶菌群。
关键词：卤虫；肠道；菌群结构；不同产地；成虫期中图分类号：S955.34
文献标志码：A
文章编号：2095-1191（2018）09-1841-08
StructureofintestinaltractbacterialcommunitiesofadultArtemiaparthenogeneticafromdifferentproducing
areasunderindoorculture
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RUWen-hong1，，DUANYa-fei1，ZHENGXiao-ting3，DONGHong-biao1，LIUQing-song1，ZHANGJia-song1*
（1SouthChinaSeaFisheriesResearchInstitute，ChineseAcademyofFisherySciences/KeyLaboratoryofSouthChinaSeaFisheryResourcesExploitation&Utilization，MinistryofAgricultureandRuralAffairs，Guangzhou510300，
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China；CollegeofFisheriesandLifeScience，ShanghaiOceanUniversity，Shanghai201306，China；Laboratoryof
Aquaculture&ArtemiaReferenceCenter，GhentUniversity，Ghent9000，Belgium）Abstract：【Objective】Thecompositionandthestructurecharacteristicsofintestinaltractbacterialcommunitiesin
adultArtemiaparthenogeneticaunderindoorculturewereexplored，whichprovidedreferenceforthehealthybreedingofA.parthenogenetica.【Method】Inthisstudy，theA.parthenogeneticacystsfromtheOmskofRussiaandtheBarkolandBohaiBayofChinawereusedasexperimentalsubjects.Firstly，thecystsofthesethreedifferentproducingareaswerehatchedandculturedtotheadultstage.ThebacterialcommunitiesharboredintheintestinesofA.parthenogeneticaofthedifferentproducingareasandtheirstructurefeatureswereanalyzedbyusing16SrDNAhighthroughputsequencingtech-nique.【Result】Anaverageof53455effectivesequenceswereredfromeachsample，resultinginatotalof481096valida-tedsequencesobtainedinIlluminaMiSeqsequencing.Proteobacteria，BacteroidetesandFirmicuteswerethedominantbacteriaintheintestinaltractbacterialcommunitiesofA.parthenogeneticaofdifferentproducingareas，andtheirrelativeabundanceintheintestinebacterialcommunitywereabove97.0%.Therewere291commonOTUsintheintestinaltractbacterialcommunitiesofA.parthenogeneticaofdifferentproducingareas，thenumberofcorrespondingOTUsequencesaccountedfor95.04%ofthetotalnumberofsequences.Pseudomonashad29OTUs，anditscorrespondingsequencenum-收稿日期：2018-03-08基金项目：广东省自然科学基金项目（2017A030313147）；农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室开放基金项目
（FREU2017-01）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项项目（2016TS07，2017YB15）
作者简介：*为通讯作者，张家松（1971-），博士，研究员，主要从事设施渔业养殖研究工作，E-mail：jiasongzhang@hotmail.com。
茹文红（1991-），研究方向为浮游动物生物学，E-mail：ruwenhong@126.com
·1842·南方农业学报49卷beraccountedfor31.25%ofthetotal.Halomonashad15OTUs，anditscorrespondingsequencenumberaccountedfor
16.44%ofthetotal.AltererythrobacterhadnineOTUs，anditscorrespondingsequencenumberaccountedfor12.00%ofthetotal.A.parthenogeneticaintestinaltractmicrobialcommunitiesfromdifferentproducingareasalsoexisteddifference.TherelativeabundanceofAltererythrobacterandLeeuwenhoekiellaintheintestinebacterialcommunityofA.parthenoge-neticafromOmskofRussiawassignificantlyhigherthanthatfromBarkolandBohaiBayregionsofChina（P<0.05，thesamebelow）.TherelativeabundanceofExiguobacteriumintheintestinebacterialcommunityofA.parthenogeneticafromBarkolofChinawassignificantlyhigherthanthatfromOmskofRussiaandBohaiBayofChina.Idiomarinaap-pearedonlyintheintestinaltractbacterialcommunityofA.parthenogeneticafromBohaiBayofChina.【Conclusion】ThecompositionofintestinaltractbacterialcommunitiesofA.parthenogeneticarelatesstronglywiththewaterenvironmentandfeed.Therefore，theproportionofcommonintestinaltractbacterialcommunitycanbeincreasedbyadjustingthecon-sistencyoftheaquaculturewaterenvironmentandthefeeding.Thebeneficialbacteria，whichinvolveinfooddigestionandabsorptionintheintestinaltractofA.parthenogenetica，canbeusedasatargetbacterialcommunityforstudyingthegrowthmechanismofA.parthenogeneticainthefuture.
Keywords：Artemiaparthenogenetica；intestinaltract；structureofbacterialcommunity；differentproducingareas；adultstage
0引言
【研究意义】卤虫（Artemia）别名盐水丰年虫、盐水虾，是一种小型低等水产甲壳类动物，分布在许多碳酸盐和硫酸盐的自然湖泊和人工盐池中，隶属于甲壳纲卤虫属（黄旭雄和陈马康，2000）。卤虫是一种典型的非选择性滤食动物，50μm以下的颗粒状物质如有机质碎屑、微藻和细菌等均可被摄食（张颖等，2018）。自1933年美国学者Seale发现卤虫无节幼体是仔稚鱼的最佳饵料以来，卤虫在海水养殖生产中即得到广泛应用，其人工养殖技术也不断完善。动物肠道是营养物质消化和吸收的主要场所，而肠道内的微生物是宿主肠道的重要组成部分（Walteretal.，2011；Rungrassameeetal.，2016）。肠道微生物通过影响宿主的免疫、营养吸收及消化而对其健康产生影响（Leyetal.，2008；Roeselersetal.，2011），因此，明确室内培育卤虫肠道的微生物组成对开展人工健康养殖卤虫具有重要意义。【前人研究进展】目前，有关卤虫的研究主要集中在卵生物学特征、人工养殖技术、生长发育、繁殖特性等基础生物学方面。黄玉玲（2004）概述了盐田增殖、盐田养殖、水池养殖和循环流水养殖4种人工增养殖模式，以期为因地制宜开展卤虫人工养殖提供参考；杨志强等（2005）对比6个不同产地的卤虫生物学特性，结果发现干燥卵卵径、去壳卵卵径、吸水卵卵径与无节幼体体长呈显著相关；王素凤（2009）测定了我国7个产地卤虫卵的生物学特征值，发现其卵径和卵颜色与海拔高度密切相关，而卵径与其成体的生殖方式无直接关联；王婧等（2012）研究表明，在春夏季和低盐度环境下孤雌品系卤虫种群占绝对优势，而在秋季和较高盐度下两性生殖卤虫种群逐渐占据优势；Aru-mugam等（2013）采用不同形式的螺旋藻粉投喂卤虫，结果发现以脂质体包裹的螺旋藻粉最有利于卤虫生长；陈迪虎和刘晓冬（2013）对卤虫在冬季和夏
季的孵化和养殖条件进行探索，结果表明，冬季的孵
化温度为22~24℃、养殖温度为20℃，而夏季的孵化温度为30℃、养殖温度为24℃；李景和徐永健（2013）探讨不同光照强度、温度和盐度对卤虫幼体生长发育的影响，结果表明，最适的光照强度为0.5×103lx，最适生长温度为26℃，最适生长盐度为74.03‰；彭瑞冰等（2013）研究表明，卤虫的最佳饵料组合为三角褐指藻+酵母液；隋丽英和王娇（2014）研究表明，卤虫卵和无节幼体大小与其种群及地理分布密切相关，但营养组成与卤虫种群及地理分布的关联不明显；贺婷婷等（2016）研究发现，在非极端光周期下，艾比湖卤虫的临界光暗时长为8.38±0.37h，感知光照度处于10~50lx时卤虫的滞育率较高。【本研究切入点】针对卤虫肠道及肠道微生物的研究，Gunasekara等（2011）通过立体显微镜、光学显微镜和电子显微镜观察不同生长时期卤虫肠道的组成结构，发现卤虫肠道是一个呈钩形的管状结构，包括前肠、中肠和后肠三部分；Motlagh等（2012）研究枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）和芽孢杆菌（B.li-cheniformis）对卤虫肠道微生物的影响，结果发现其肠道内芽孢杆菌数量增多，而弧菌数量减少；但至今鲜见采用高通量测序技术研究卤虫肠道微生物结构的相关报道。【拟解决的关键问题】以卤虫（A.par-thenogenetica）为研究对象，分别选取俄罗斯鄂木斯克地区及我国巴里坤和渤海湾产地的卤虫卵进行孵化，人工养殖至成虫期后采用16SrDNA高通量测序技术分析不同产地卤虫肠道内的菌群组成及结构特征，以期为开展人工健康养殖卤虫提供参考依据。
1材料与方法
试验材料
以俄罗斯鄂木斯克地区（LA）及我国巴里坤（LB）和渤海湾（LC）产地的卤虫休眠卵为材料，养殖和孵化用水为盐度30‰、pH8.3的人工海水，投喂饵1.1
9期茹文红等：室内培育不同产地卤虫的成虫肠道菌群结构分析
·1843·料为螺旋藻粉。人工海水是采用广州市海神水族科技服务公司的海水晶与蒸馏水按一定比例混合，曝气2d，过100目筛绢网后，121℃高压灭菌30min。饵料配制参照Marques等（2006）的方法，螺旋藻粉使用前进行灭菌消毒，再与灭菌人工海水混匀。1.2试验设计
将不同产地休眠卵孵出的卤虫幼体置于1000mL培养瓶中进行养殖，养殖密度4尾/mL，每个产地卤虫均设3个平行，养殖至卤虫成虫期进行采样。1.3卤虫孵化和养殖
卤虫卵的消毒和孵化参照Baruah等（2011）的方法：取卤虫卵400mg，用蒸馏水浸泡并曝气1h。加入32%氢氧化钠（660μL）和50%次氯酸钠（10mL）进行消毒（100s），加入10g/L硫代硫酸钠（14mL）孵育2min，最后用人工海水洗涤至无色。将消毒脱壳的卤虫卵放入盛有60mL人工海水的培养瓶中孵化24h，孵出的卤虫幼虫置于培养瓶中进行养殖。卤虫的孵化和养殖条件：温度30℃，盐度30‰，pH8.3，光照强度2000lx，全天使用0.22μm空气过滤器过滤曝气。养殖期间，每天下午16：00以一次性注射器投喂饵料，投喂量8mg/L（李信书和彭永兴，2004；Arumugametal.，2013）；隔天换水1次，每次换水1/2。
1.4样品采集处理及生物信息学分析1.4.1样品采集根据卤虫的发育分期（赵光平，2014），采集各平行养殖组卤虫成虫（十二令期）100尾。在无菌条件下，利用卤虫的趋光性，以灭菌吸管吸取卤虫个体置于150目网筛中，经无菌海水冲洗后用70%酒精冲洗10s，最后以灭菌海水冲洗3次Motlaghetal.，2012；Niuetal.，2012），液氮冷冻处理后-80℃保存备用，用于卤虫肠道细菌DNA提取。1.4.2样品处理参照Zheng等（2016）的方法提取卤虫肠道细菌DNA，采用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，再以TBS380荧光光度计检测DNA浓度、Ther-moScientific微量核酸检测仪检测OD260/OD280。
以通用引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和806R（5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3'）扩增细菌16SrDNA的V4~V5区，PCR反应体系25.00μL，包括5×ReactionBuffer4.00μL，5×GCBuffer5.00μL，2.5mmol/LdNTP2.00μL，10μmol/L正、反引物各1.00μL，DNA模板2.00μL，ddH2O8.75μL，Q5High-FidelityDNAPolymerase0.25μL。扩增程序：98℃预变性2min；98℃15s，55℃30s，72℃30s，进行30个循环；72℃延伸5min。采用2%琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，以凝
胶回收试剂盒（美国Axygen公司）回收目标片段，并
以Quant-iTPicoGreendsDNAAssayKit试剂盒进行荧光定量分析。按照测序量需求，对各样本按相应比例进行混合，使用TruSeqNanoDNALTLibraryPrepKit建库试剂盒构建测序文库，经AgilentBioanalyzer质检和PromegaQuantiFluor荧光定量分析确定文库合格后，进行IlluminaMiSeq测序。
1.4.3生物信息学分析对IlluminaMiSeq测序的原始下机数据根据序列质量进行初步筛查，通过质量筛选的序列按照PCR引物和Barcode信息，识别分配入对应样品，截去Barcode和引物序列，利用FLASHv1.2.7（http：//ccb.jhu.edu/software/FLASH/）对各样品的Reads进行配对连接，获得原始Tags数据RawTags）；然后过滤去除疑问序列和嵌合体序列，以获得有效序列（EffectiveTags）。利用QIIME中的UCLUST对获得的高质量有效序列按97.0%的序列相似度进行归并及OTU划分，并选取每个OTU中丰度最高的序列作为其代表序列，在Greengenes数据库Release13.8，http：//greengenes.secondgenome.com/）、RDP（RibosomalDatabaseProject）数据库（Release11.1，http：//rdp.cme.msu.edu/）或Silva数据库（Re-lease115，http：//www.arb-silva.de）进行搜索比对分析，以获得每个OTU所对应的分类学信息（置信度阈值默认为0.8以上）。利用R软件对OTU各分类等级水平［Kingdom（界）、Phylum（门）、Class（纲）、Order、Family（科）和Genus（属）］的注释比例和物种相对丰度进行统计，绘制OTU级别的Venn图。使用QIIME获取各样本在门、纲、目、科和属分类水平上的组成和丰度分布表，绘制特定样本在特定分类水平的组成柱状图；计算每个样本的Chao1、ACE、Simpson、Shannon等α多样性指数及两种β多样性距离（WeightedUnifrac和UnweightedUnifrac），并对Unweighted和Weighted的UniFrac距离矩阵分别进行UPGMA聚类分析。1.5统计分析
采用SPSS17.0对所有试验数据进行统计分析，利用Oneway-ANOVA对统计结果进行单因素方差分析，并以Duncan’s多重比较检验组间差异显著性。
2结果与分析
2.1
IlluminaMiSeq测序结果
9个肠道细菌样品经IlluminaMiSeq测序及质量筛查后共得到481096条有效序列，平均每个样品有53455条有效序列。序列长度主要分布在391~395bp，平均为393bp。3个产地分别获得663~996个不
（（（（目）
___________室内培育不同产地卤虫的成虫肠道菌群结构分析___________
