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采用响应曲面法对Capto adhere填料进行工艺优化
作者：吴光昊 何慧丹 徐翀颿 顾鑫 刘彦君 来源：《上海医药》2020年第09期
摘 要 为对复合阴离子Capto adhere 填料进行纯化工艺优化，在前期单因素试验基础上，CHO细胞表达的IgG1型单克隆抗体细胞培养上清液经亲和层析纯化后，采用中心复合表面设计（CCF）法优化Capto adhere 填料纯化工艺。以收率、纯度、HCP清除率为响应变量，考察pH、电导率、载量3个关键因素对纯化工艺的影响，拟合模型并验证。优化后最佳工艺条件为：pH 7.0，电导率 16.4 ms/cm，载量300 mg/ml，在此条件下，收率、纯度和HCP清除率分别可达（90.77±0.77）%、 （99.55±0.05）%和（88.93±2.14）%。与预测结果偏差均 关键词 中心复合设计 Capto adhere 抗体纯化
中图分类号：TQ464.7 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2020）09-0067-05 Optimization of Capto adhere purification conditions using response surface design WU Guanghao1*， HE Huidan1， XU Chongfan1， GU Xin1， LIU Yanjun2
（1. Shanghai Jiaolian Drug Research and Development Co.， Ltd.， Shanghai 201210， China； 2. Central Research Institute， Shanghai Pharmaceuticals Holding Co.， Ltd.， Shanghai 201210， China）
ABSTRACT In order to optimize the purification process of multimodal anion exchange chromatography media Capto adhere， the purification process by Capto adhere was optimized by central composite surface design method after the cell culture supernatant for the expression of
monoclonal antibody IgG1 in CHO cells was purified by affinity chromatography. The effects of three key factors such as pH value， conductivity and load on the purification process were investigated using the yield， purity and HCP removal rate as responses， and then the fitting model was validated. The conditions for optimum process were pH 7.0， conductivity 16.4 ms/cm and load 300 mg/ml. The results showed that the yield， purity and HCP removal rate were（90.77±0.77）%， （99.55±0.05）% and （88.93±2.14）%， respectively. The deviations from the predicted results were all less than 5% and the model was validated. The experimental results show that the optimization of purification process by Capto adhere is effective and feasible. KEy WORDS center composite design； Capto adhere； antibody purification
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近年來，治疗性单克隆抗体（monoclonal antibodies，mAbs）药物在许多疾病治疗（如癌症）方面扮演着重要的角色，该治疗方法需要在长时间内供给高剂量的抗体[1]。面对高需求量的单克隆抗体药物市场，生物公司需要开发新的上下游抗体工艺以减小生产成本。对于上游单抗生产来说，现在的抗体滴度已能达到5～10 g/L；对于下游的抗体纯化来说，一般的三步纯化步骤可占总生产成本的50%～80%[2]：首先通过亲和层析捕获目的蛋白同时去除大量的宿主细胞蛋白残留（host cell protein， HCP），DNA以及病毒；然后通过两步纯化（中度纯化、精细纯化，通常为离子交换层析和疏水层析的组合）进一步去除HCP、聚体以及蛋白A（protein A，PA）[3-4]。为提高纯化效率和抗体收率，减少生产成本，复合层析填料应运而生。
Capto adhere是一种应用于生物过程技术的复合阴离子填料，配基为N-苄基-N-甲基乙醇胺，该配基同时具有：①离子相互作用；②氢键作用；③疏水作用。在流穿模式下，Capto adhere可吸附HCP，PA，病毒，内毒素等，而抗体流穿，一步去除关键杂质，可与亲和层析结合组成两步纯化工艺进而达到提高收率的目的[5]。 试验设计（design of experiments，DOE）是一种基
于数理统计原理研究多个因子与响应变量关系的一种科学有效的方法，其中响应曲面法在生物过程优化应用中最为广泛[6]。为实现流穿模式下Capto adhere填料性能的最优化，本试验在前期单因素试验基础上，采用试验设计的方法，对三种关键工艺参数pH，电导率，载量进行优化，作为放大生产的依据。 1 材料和方法 1.1 材料
AKTA avant、填料Mabselect及填料Capto adhere（柱体积CV=1.7 ml）购自美国GE公司；层析柱购自美国Millipore公司；无水枸橼酸、二水合枸橼酸钠（湖南尔康制药股份有限公司）；Tris（Applichem Gmbh-An ITW公司）。
培养液是经上游CHO细胞培养表达的IgG1单克隆抗体（自主研制生产），经过Mabselect亲和层析纯化后得到800 ml样品，浓度为13.7 mg/ml，纯度为98.2%，HCP残留的体积分数为0.297 1%。 1.2 方法
1.2.1 中心复合表面设计
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在前期的单因素试验中，确定pH、电导率、载量的范围分别为：5～7，3～20 ms/cm，100～300 mg/ml。根据CCF试验设计原理采用Design-Expert V8.0.6.1（Stat-Ease Inc.， Minneapolis， MN）进行响应曲面设计（表1）。
选择中心点重复试验3次，系统生成17个试验，包括8个角点，6个轴点，1个中心点（重复试验3次），未设计分组。本次试验按照系统所生成的随机顺序进行（表2）。 1.2.2 样品处理
配制20 mmol/L枸橼酸缓冲液，pH和电导率如表2，然后分别用1 mol/L Tris溶液和20 mmol/L枸橼酸+1 mol/L NaCl溶液调节pH和电导率使与缓冲液一致，样品来源于Mabselect亲和层析纯化得到的产物。
采用响应曲面法对Capto adhere填料进行工艺优化
