Open Journal of Nature Science 自然科学, 2020, 8(3), 187-195
Published Online May 2020 in Hans. http://www.hanspub.org/journal/ojns https://doi.org/10.12677/ojns.2020.83025
A Study on the Rapid Propagation Technology of Water-Free Virus Seeds
Piaopiao Chai1*, Changxu Chen1*, Xiaojie Chu1, Xiaorong Chen2, Mengfei Yang2, Yipeng Li2, Shangfa Zhang2, Xiaojun Zha1#
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College of Chemistry and Life Sciences, Zhejiang Normal University, Jinhua Zhejiang Jinhua Academy of Agricultural Sciences, Jinhua Zhejiang
stthnd
Received: May 1, 2020; accepted: May 15, 2020; published: May 22, 2020
Abstract
Through the study of the tissue culture of T. chinensis explants with different hormone concentra-tion ratios, a suitable system for in vitro regeneration of T. chinensis has been established, and it also provides a good test material for artificial inoculation of T. glutinosa. In this paper, the shoots of the underground plant and the stem tip of the white seedlings about 40 cm in height were used as explants, and the corresponding biological hormones such as NAA, 6-BA, and KT were added on the basis of the MS culture medium, and some explant pollution was taken. The anti-brown method completes disinfection of explants, induction of buds, proliferation, and selection of plant growth regulators in the rooting medium. Some results have been achieved in cultivating the white vi-rus-free seedlings.
Keywords
Zizania latlfolia Turcz, Stem Tip, Tissue Culture
茭白脱毒苗组织快繁技术研究
柴飘飘1*，陈昶旭1*，褚晓洁1，陈晓荣2，杨梦飞2，李怡鹏2，张尚法2，查笑君1#
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浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江 金华 金华市农业科学研究院，浙江 金华
收稿日期：2020年5月1日；录用日期：2020年5月15日；发布日期：2020年5月22日
*
共一作者。 #
通讯作者。
文章引用: 柴飘飘, 陈昶旭, 褚晓洁, 陈晓荣, 杨梦飞, 李怡鹏, 张尚法, 查笑君. 茭白脱毒苗组织快繁技术研究[J]. 自然科学, 2020, 8(3): 187-195. DOI: 10.12677/ojns.2020.83025
柴飘飘 等
摘 要
通过不同生物激素含量和浓度的配比对脱毒苗茭白外植体组织培养的方法进行研究，确立了一套安全适宜的茭白离外植体组织再生培养体系，也为茭白苗人工培育和接种茭白菰黑粉菌提供一个良好的环境和试验材料。本文以茭白脱毒苗植株地下部分的芽和高约40 cm茭白脱毒苗的茎尖为外植体，在高约40 ms生根培养基的基础上通过添加NAA、6-BA、KT等激素及相应的生物素对外植体进行了诱导，并在基础上采取了一些外植体组织污染抗褐的方法，完成了对外植体消毒、芽的诱导、增殖和茭白生根外植体培养基中所含的植物激素和生长环境调节剂的筛选。在人工培育茭白外植体脱毒苗中，取得了一定的成效。
关键词
茭白，茎尖，组织培养
Copyright ? 2020 by author(s) and Hans Publishers Inc.
This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
Open Access 1. 引言
茭白(Zizania latlfolia Turcz.)别称茭瓜、茭笋、高瓜、菰等，是禾本科菰属(Zizania Gronov. ex L.)的植物[1]。在系统发育上，该属在禾本科中占有一个重要的根系分枝。与李氏禾属(Leersia)一样，菰属也是离禾本科稻属最近的属[2]。目前，人们已经成功驯化了两个菰属的成员：一年生沼生菰(Zizania palustris)，原产于欧洲和北美，被人们称为“野生稻”[3]；以及多年生菰(Zizania latifolia)，原产于北美和亚洲，被人们称为“茭白”[3] [4] [5]。早在大约2000年前，茭白就被人们驯化为一种重要的蔬菜和经济作物，秦朝(公元前207~221年)的第一部汉语词典《尔雅》中就提到了这一点。由于茭白在营养和经济上的重要性[6]，它现在在中国和一些其他的亚洲国家中被广泛种植。
有研究结果表明，茭白孕茭与其茎基部内生的肉质茎菰黑粉菌(Ustilago esculenta)的侵染互作密切的相关[7]。菰黑粉菌的侵染抑制了茎基部的茭白开花并同时刺激了茎基部的膨大从而形成可食用的白茭肉质茎[8]。但若灰茭的菰黑粉菌未成功侵染则过早形成雄茭，成功侵染的菌丝中灰茭潜育期的缩短则过早侵入形成冬灰茭的孢子，从而使灰茭成为不能直接食用的灰茭，植株的生长和分蘖可能趋于迅速衰退[9]。雄茭和灰茭都认为不可以直接食用。由此可知，茭白黑粉菌也是导致茭白肉质茎膨大的重要因素[10]。然而茭白的孕茭生长机制、形成的机理，黑粉菌对于单、双季茭肉质茎形成的主要影响，以及茭白生产上由于黑粉菌形成的雄茭和灰茭的主要原因等诸多问题尚不明确，这些问题严重地限制了我国茭白优质高产青灰茭栽培的重要性和发展。
如何准确验证接种茭白孕茭和黑粉菌的密切联系，就是需要人工接种茭白黑粉菌脱毒苗的组织培养及人工的接种黑粉菌脱毒苗来验证完成。水生蔬菜如茭白芋头、莲藕、慈姑和荸荠等的组织培养技术研究报道较多，而茭白脱毒苗作为一种无性繁殖的水生植物，关于其黑粉菌的再生发育体系的培养技术研究报道较少[10]。在这些组织培养研究中，基本研究都是以黑粉菌胚芽作为外植体，附加75%的酒精和次氯酸钠对黑粉菌进行外植体的消毒，芋头和莲藕中添加2,4-D和TDZ形成的愈伤组织[11] [12]。茭白的愈伤组织中的诱导培养基添加了2,4-D、IAA、VB1和谷胱酰胺[13]。1.0 mg/L IAA + 1.0 mg/L 6-BA适宜
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外源激素诱导原球茎出芽，这两种茭白外源激素的联合使用与王怀利[14]外源激素诱导的茭白原球茎相同，但外源激素浓度稍高。王怀利等[15]茭白原球茎侧分生组织外源激素诱导原球茎出芽，所用的外源激素诱导原球茎培养基的配方如下：MS + IAA 0.5 mg /L + 6-BA 0.5 mg /L + VB1 4 mg /L + KT 1 mg /L + 0.1%的活性碳。茭白的茎侧芽分生组织诱导接种在该分生组织诱导的培养基上，经30 d左右的培养，分生组织的生长点在其颜色逐渐变绿，顶部膨大，60 d以后，在其顶部逐渐产生嫩绿的原球茎。但是还有许多的地方有待专家尽一步完善，如活性炭的吸附机理是完全没有任何选择性的，在外植体内吸附酚、醌的同时也可能会直接吸附体内的营养代谢物质和生长激素，影响外植体的正常发育和生长[16]；生长素IAA在黑粉菌的体内很容易经过新陈代谢而被营养物质破坏，所以黑粉菌在外施时的效果短暂[17]。而且，在这些黑粉菌的研究中，基本采用的是以未发育孕茭的雄茭黑粉菌作为组织培养的外植体培养材料，尚未充分体现黑粉菌在茭白体内的正常生长状态的密切关系，因此我们需要探究以正常茭作为外植体材料培育脱毒苗的组织培养技术。
植株遗传再生培养体系中主要培养目的之一就是增殖，丛生芽增殖的2,4-D和TDZ是用于芋头丛生芽增殖和外植体培养的主要两种外源激素，6-BA和NAA是用于慈姑、莲藕和荸荠丛生芽增殖的主要两种外源激素[18]。不同的外植体组织和部位丛生芽增殖的培养方式不同，采用薄层的培养对外植体产生的再生芽增殖进行有效的增殖，增殖的系数一般为4左右[19]。外植体薄层的培养(micro cross section)是将外植体横切成大约1 mm厚的薄片进行培养，香蕉和马铃薯植株进行这种薄片的培养，这样能够有效地诱导大量的丛生植株发芽，薄层培养是优良的农杆菌转化受体，横切面的培养期间伤口较大，增大了植株转化的几率。在这种薄片的培养期间进行农杆菌遗传侵染，建立了一种简便、高效的农杆菌遗传转化植株再生体系，也就是建立了一种简便、高效的遗传转化体系[10]。
生根和驯化是检验再生体系成功与否的关键阶段，NAA的主要作用就是促进根和不定根的形成，使用0.5 mg/L NAA可成功诱导生根，而组培苗从适宜生长的无菌条件转入大田种植需要一个过渡阶段来提高成活率，即驯化。茭白组织培养再生体系的初步研究为今后研究茭白孕茭提供有效方法以及通过茭白脱毒培育不同品种雄茭，同时也可为不同类型黑粉菌接种培育茭白新品种奠定基础。
2. 材料与方法
2.1. 试验材料
试验材料取自金华市农科院。以“浙茭911”为材料诱导茭白茎尖分化。
2.2. 试验方法
2.2.1. 外植体的制备
在大田养殖场采集整株的茭白，保湿晾干后带回实验室，以茭白茎尖和植株地下部分的嫩芽(如图1(A))为外植体，剥去茭白表面包被着的叶片，剥取茭白的茎尖，滴入酒精后加一滴中性洗洁精，用流水冲洗30 min，移至大田的超净台，以下的操作均在超净实验台中进行：先用75%的酒精将外植体浸泡1 min；然后用无菌水将外植体清洗一遍；再用15%的次氯酸钠 + 0.1%吐温?80的溶液中无菌水消毒30 min；然后再用无菌水将外植体清洗2~3次，置于无菌水的滤纸上充分地吸干外植体的水分；最后采取0.5~1 cm的外植体将茭白茎尖接种于MS培养基上进行诱导。
消毒溶液及时间处理
采用75%的加热酒精溶液消毒2~3次(10 min)，无菌水清洗2次，结合不同的的浓度吐温?80和消毒药剂溶液和使用的时间(15 min、20 min、30 min)。每个处理30个外植体左右，一周后记录污染率和褐化率。
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2.2.2. 培养基的制备和培养条件
采用MS固体培养基进行培养，并在MS固体培养基中加入蔗糖30 g/l作碳源，加入2.5 g/l植物凝胶作固化剂。根据不同的培养发育阶段的植物芽发育和生长状态，分别通过添加不同培养浓度的NAA、6-BA、KT共同培养诱导不定芽和根的生长分化。培养的容器用250 ml的三角瓶，培养室温度控制在(25 ± 2)℃，光照强度为2000~3000 lx，光照时间为16 h/d。为解决茭白茎尖组培过程中褐化问题，设了以下四种培养基：
预培养培养基：MS基础培养基，PH = 5.8~6.2，预培养2~3天；
分化培养基：MS + 0.5 mg/l NAA + 0.5 mg/l 6-BA + 0.5 mg/l KT，PH = 5.8~6.2，一周左右再转接一次； 分化继代培养基：MS + 0.5 mg/l NAA + 0.5 mg/l 6-BA + 1 mg/l KT，PH = 5.8~6.2； 生根壮苗的常用培养基：1/2 MS + 0.5 mg/l NAA, PH = 5.8~6.22。
3. 结果与分析
3.1. 消毒溶液及时间对芽污染率和褐化率的影响
由以下表1可清楚得知，不同的外植体运用不同的的消毒方法进行消毒，不同的消毒溶液浓度和不同的外植体消毒的持续时间分别对外和内植体进行了多次消毒，结果从中可以明显发现(表1)，次氯酸钠消毒溶液需要消毒的药物浓度不能过低或过高，消毒的持续时间短或长，均达不到良好的污染率和消毒杀菌效果，而且由于外植体的发芽组织幼嫩，使用过高的次氯酸钠溶液的消毒会使得发芽组织软化发黄、无法正常生长。而15% NaClO + 0.1% 吐温-80和15% NaClO的消毒组合可以使外植体达到较好的污染率和消毒杀菌效果，显著地降低了外植体的污染率和内植体的褐化率。以各品种消毒持续时间一般为15 min的消毒效果最佳，污染率一般为56%，褐化率为0.3%。因此，在外植体进行消毒的过程中，要通过多次实验，选择合适的消毒试剂浓度及时间，以达到最佳效果[20]。
Table 1. Effect of disinfection solution and time on bud pollution rate and browning rate 表1. 消毒溶液及时间对芽污染率和褐化率的影响
消毒溶液 30% NaClO
15% NaClO + 0.1% 吐温?80或15% NaClO
30% NaClO + 0.1% 吐温?80 30% NaClO + 0.1% 吐温?80
消毒时间(min)
20 各15 20 30
芽污染率(%)
100 56 83.3 30.4
褐化率(%)
0 0.3 50 43.5
3.2. 茎尖分生组织诱导分化成芽
在诱导茭白茎尖分化成芽的过程中，通过多次实验，选择合适的激素配比，以达到最佳效果。先选用茭白诱导用培养基：MS + 0.5 mg/L NAA 0.5 + 0.5 mg /L 6-BA + 0.5 mg /L KT (表2)，茭白茎侧芽分生组织接种在茭白诱导用培养基上，经5~6 d左右的培养，分生组织侧芽生长点的颜色逐渐变绿，顶部膨大(如图1(B))，20 d左右，不定芽分化较壮，这组的生芽率高达37.5% (表2)。
3.3. 不定芽的分化和继代培养
在继代培养中，通过多次实验，选择合适的激素配比，选择生芽率最高的一组，分化继代培养基为MS + 0.5 mg/l NAA + 0.5 mg/l 6-BA + 1 mg/l KT (表2)，待植株生长较为健壮转至一个继代生根培养基。30 d左右生根茭白植株的基部有根生出(如图1(C))，生芽率高达50% (表2)。在原球茎的增殖和生根发芽
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的分化与生根茭白培养中，激动素对种类和含量的变化起着十分重要的抑制作用[14]。生根培养方法是将茭白诱导成功的不定芽的基础上，将不定芽接种在一个继代生根分化培养基上，15 d左右，在原球茎上形成一株完整的植株。
3.4. 茭白生根壮苗培养
当茎尖接种苗萌发至2 cm左右时，将新芽茎尖的小苗接种到带激素的1/2 MS + 0.5 mg/l NAA (表2)生根壮苗的培养基中(如图1(D))。最后用一层封口膜将培养基密封，放置于25℃培养箱，光照充足即可培养。已接种的小苗经15 d左右的光照培养，长出3~5条根，植株较壮，即可移植大棚。
Table 2. The effect of different hormone ratios on the germination rate and rooting rate in the differentiation medium 表2. 分化培养基中不同激素配比对于生芽率和生根率的影响
分化培养基配方
MS + 1 mg/l IAA + 1 mg/l 6-BA
MS + 0.5 mg/l NAA + 0.5 mg/l 6-BA + 0.5 mg/l KT MS + 0.5 mg/l NAA + 0.5 mg/l 6-BA + 1 mg/l KT
MS + 0.5 mg/l NAA + 0.5 mg/l 6-BA + 1 mg/l KT + 0.1%活性碳
MS + 1 mg/l 2,4-D + 1 mg/l 6-BA
生芽率(%)
45.5% 37.5% 50% 50% /
生根率(%)
0 0 80% 80% /
Figure 1. The process of tissue culture differentiation of Zizania sp. (A) Underground part of buds of wild rice plants; (B) Differentiation of buds of underground rice plants; (C) Underground bud rooting; (D) Rooting strong seedlings
图1. 茭白茎尖组培分化的过程。(A) 茭白植株地下部分芽；(B) 茭白地下芽分化；(C) 地下芽生根；(D) 生根壮苗
4. 讨论
目前，茭白的种植主要是采用茭墩分离筛选的种植方式，繁殖的系数相对较低，速度慢，种质遗传资源少，同时茭白繁殖的过程中种质受影响也有季节的局限。因此在生产上茭白若连续两年不进行选种，雄茭和灰茭的繁殖发生率将达30%左右，严重影响到当地农民的生产和经济效益[21]。因此开展茭白组培快繁的试验，对于保存茭白种质遗传资源和促进茭白育种，加速和推广茭白种植均质化具有十分重要的科学研究意义。其中，茎尖培养快繁试验是对获得无菌茭白培养物很有效的一种方法。由于目前茭白
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