犬流感病毒的生物学特性研究
陈坚 曹穗兰 指导老师：贺东生华南农业大学 兽医学院
摘要：从广州市各宠物医院采集得患病犬只的鼻咽拭子样本，经SPF鸡胚培养分离鉴定，分离出3株疑似犬流感病毒，阳性分离株第三代血凝活性均达128：1以上，而且均不被新城疫阳性血清所凝集，与H3和H9亚型标准血清血凝抑制价为8：1，与H5型标准血清血凝抑制价为256：1，进行红细胞凝集谱测定，其中两株病毒只能凝集鸡的血球和狗的血球；一株除了可以凝集鸡、狗的血球以外，还可以凝集猫，牛，兔的血球。
关键词:犬流感病毒;分离鉴定；生物学特性
流感病毒属分节段负股RNA病毒，属正黏病毒科，分为A、B、C三型，A型流感病毒可以感染禽、猪、马等多种动物和人，B型流感病毒仅感染人，C型流感病毒感染人和猪，其中C型流感病毒感染极少引起严重疾病，A型禽流感病毒不但感染禽、猪等多种动物和人，还可以感染猪，犬猫等小动物。多种研究证实：流感病毒中控制N和H的基因可以发生重组，各种流感病毒之间有着密切的联系，可在特定的动物宿主中重组成新的变异毒株，并引发跨物种传播，进而感染人类，威胁人类的生命安全，而在当前，犬作为一种常见的家养宠物，与人类的接触十分的密切，故而，对犬流感病毒的研究极具意义。目前，国外对犬流感病毒的研究已经较为成熟，但国内对犬流感病毒的研究却非常少，病毒分离非常困难，分离率很低，从而极大地影响了对流感病毒进一步的科学研究。针对这种情况，我们在前期创新研究犬流感分离工作的基础上，继续进行犬流感病毒的分离鉴定工作，并对其进行血清型鉴定、红细胞凝集谱等生物学特性的研究，现报告如下。
1材料准备
1.1样品采集
疑似流感发病犬只样品的采集：
2005年4月－2006年3月，从广州的部分宠物医院对疑似犬流感病例进行鼻咽拭子的采集，早期的采集对象以出现呼吸道症状的犬只为主，后期根据国外对犬流感的报道研究，针对具有典型流感症状的犬只进行采样，主要判断治标为：呼吸道症状，低烧，流涕，抗生素治疗无效等。先后采集鼻咽拭子一共
份，采得的拭子放入含2500单位/ml双抗保存液中，放4℃冰箱中备用。1.2病料处理
样品取其上清液，按每毫升1000单位的含量加入青链霉素，进行无菌处理，放于4℃冰箱备用。
1.3 10×PBS液的制备
氯化钠 8.5g，磷酸二氢甲 0.68g，氢氧化钠 0.15g，溶於100ml水中高压灭菌，十倍稀释。1.4 阿氏液制备
葡萄糖 20.5g，氯化钠 4.2g，柠檬酸钠 8.0g，柠檬酸
0.55g，加于100水中，115℃，15min高压灭菌，调节PH值至6.8～7.2之间，4℃保存备用。
1
1.5
标准阳性血清和抗原流感病毒H5、H7、H9标准阳性血清和鸡新城疫(ND)标准阳性血清由华南农业大学传染病研究室提供。
1.6 SPF鸡胚由广东永顺生物制品厂SPF种禽饲养室提供。1.7
1%鸡红细胞、牛红细胞、兔红细胞、犬红细胞、猫红细胞由华南农业大学传染病实验室提供。所有红细胞用PBS洗3遍，前两次用1500rpm离心两次，每次5分钟，最后一次用2000rpm离心10分钟，将离心得的红细胞一毫升加入100ml阿氏液中，配成l%悬液，置4℃保存待用。
2方法
2.1 病毒分离
采用鸡胚接种绒毛尿囊腔接种分离的方法2.11
9－11日龄SPF鸡胚，由广东永顺生物制品厂提供的SPF种蛋孵化。取上述制备的样品上清液，经绒毛尿囊腔接种，每个样品接种一个胚，0.2ml/胚，置37℃温箱中继续孵。2.12 孵育2－4天，每天照胚2次，收留死胚，细菌检查为阴性后转放入4℃冰箱。2.13
采集鸡胚的绒毛尿囊液进行血球凝集(HA)试验，若出现血凝活性，则继续传代并测定血凝价。若血凝价为阴性，则转入－20℃冰箱保存。2.14
将首次收取的HA未有血凝活性的鸡胚尿囊液与其它首次接种收胚后不表现血凝活性的样品收得的尿囊液得进行随机分组，每5个样品尿囊液一组，将同一组的尿囊液每个取0.4ml混合，震荡，再次接种鸡胚传代，方法同上。2.15
收取的尿囊液再做HA血球凝集实验，结果仍为阴性者则弃去，如为阳性，则将组内的各个样本分别接种鸡胚继续传代，直到分离得阳性毒株，并测定其血凝价。2.16 凡病毒分离阳性者均置于－20℃冰箱内保存用于病毒鉴定。2.2 病毒鉴定
2.21红细胞凝集(HA)试验
将上述各传代鸡胚尿囊液按常规进行血凝性和血凝价测定。2.22 与新城疫阳性血清进行HI试验，以排除新城疫病毒的可能性。2.23 血凝素亚型鉴定
分别用H5、H7、H9、ND血清和Hg标准阳性血清与阳性分离株的尿囊液进行HI试验。2.24 红细胞凝集谱的测定
分别采用鸡、牛、兔、犬、猫的1％红细胞悬液对上述各传代鸡胚尿囊液进行血凝性和血凝价的测定。
3 结果
3.1 病毒的分离及鉴定
2
3.1.1病毒的分离及初步鉴定:本次试验通过采用将样品接种于SPF鸡胚，收集其尿囊液进行血凝活性检测的方法，结果发现有3份样品的鸡胚尿囊液对鸡红血球有血凝活性，经鸡胚传代做HA结果如下表
表1－1 HA测定结果孔号毒株014F3028F3100F5
1###
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3###
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7++++#
8－+++++
9－+++++
10－－++
11－－－
12－－－
014第3代病毒液HA价达7孔，滴度为1：128；028第三代病毒液HA值达9孔，滴度为1：512；100第5代病毒液HA值高达10孔，滴度为1:1042。
表1－2 抗NDV阳性血清HI试验
孔号毒株编号014028100阳性对照
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5
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8
9
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12
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－－－+
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－－－－
这3株病毒与抗NDV阳性血清的HI试验为均阴性。故而，初步鉴定这3份样品分离物为流感病毒。
3.1.2病毒亚型的鉴定结果
表2－1 H5亚型鉴定结果
孔号 1毒株编号014#028
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3
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5
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7
8
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12
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－++
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－－
－－
－－
3
100
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014号毒株与H5的血凝抑制价为64:1；028与100的H5血凝抑制价为256:1；
表2－1 H7亚型鉴定结果
孔号 1毒株编号014#028100
014号毒株和028号毒株与H7的血凝抑制价为8:1；100的H7血凝抑制价为；
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6
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12
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－－－
－－－
表2－1 H9亚型鉴定结果
孔号 1毒株编号014#028100
014号毒株与H9的血凝抑制价为8:1；028的H9血凝抑制价为4：1；100不能和H9血清的产生凝集抑制。
3.13 病毒红细胞凝集谱测定结果 鸡红细胞凝集结果如表1所示
表3－1 牛红细胞凝集测定结果
孔号毒株014F3028F3
1－－
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4
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014、028第3代病毒液不能凝集牛的红细胞；100第5代病毒液与牛的红细胞凝集，HA值达9孔，滴度为1:512。100F5
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表3－2 狗红细胞凝集谱测定结果
孔号毒株014F3028F3100F5
1###
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3###
4###
5＋＋＋##
6＋＋##
7＋＋＋#
8－＋＋
9－＋＋
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12－－
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3株病毒均能与狗的红血球凝集，014第3代病毒液HA价达7孔，滴度为1：128；028第三代病毒液HA值达9孔，滴度为1：512；100第5代病毒液HA值高达10孔，滴度为1:1042
表3－3 猫红细胞凝集谱测定结果
孔号毒株014F3028F3100F5
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5－－#
6－－#
7－－#
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014、028第3代病毒液不能凝集猫的红细胞；100第5代病毒液能与猫的红细胞凝集，HA值达10孔，滴度为1:1024。
表3－4 兔红细胞凝集谱测定结果
孔号毒株014F3028F3100F5
1－－#
2－－#
3－－#
4－－#
5－－#
6－－#
7－－#
8－－
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11－－
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014、028第3代病毒液不能凝集兔的红细胞；100第5代病毒液能与兔的红细胞凝集，HA值达10孔，滴度为1:1024。
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犬流感病毒的生物学特性研究
