本科毕业论文外文翻译
译文：
毕赤酵母的原生质体和分离出的丝状真菌的细胞核融合
来源：Enzyme Microb. Technol., 1997, vol. 21, July
*PROMI, Av. Belgrano y Pje. Caseros, Tucumdn, Argentina; ‘Universidad National de San Juan;
and *Universidad National de Tucumdn, Tucumdn, Argentina
摘要：原子质体是从丝状真菌串珠镰刀菌的菌丝及里氏木霉菌中分离出来，并使用聚乙二醇作为融合剂，来融合发酵木糖酵母毕赤酵母的原生质体。混合物是似酵母的形态，当夹紧均匀电场电泳被完成时，能够表现出类似染色体模式向亲代的酵母水解木聚糖。这些杂交被孤立，同时他们的木聚糖酶活性进行定量确定。木聚糖酶活性在亲代的真菌物种在96小时时表现出最大的增长；在培养基为F时，它到达796nkat每毫升。在120小时时，串珠菌898nkat每毫升成长为T。里氏木霉菌。木聚糖酶活动在其中的一个混合物达到350nkat每毫升时，并在9小时时，毕赤酵母本身没有显示出木聚糖酶的活动。 关键词：华赤酵母；孤立丝状真菌；细胞融合 介绍
半纤维素代表着所有木本植物资料的一个重要的部分，并像是一个大型闲置的蓄水池的碳源为微生物的生长提供环境；然而，大部份的酵母无法正常代谢木聚糖和其他半纤维素的成分。这限制了他们作为碳源，为日益增加的若干环节使用酵母来生产饮料、食品、药品以及许多其他产品。丝状真菌的许多物种产生木聚糖酶和其他的水相酶,和一些发酵产生的木糖并产生乙醇。
我们正在调查发酵木糖，通过休哈塔假丝酵母，管囊酵母，和毕赤酵母成为乙醇的研究。酵母菌株的原生质体属于上面所提到的物种与酿酒酵母的原生质体融合在一起。得到了所有的混合物与木糖相似,但没有被同化了。
无论是从其它谷草转氨酶菌株中获得的核酵母株或从不相关的生物中获得的原子核，来使酵母原生质体融合被认为是可行的已有一段时间了。并且它已应用于从大鼠肝细胞核的DNA序列中获得的酵母株的构造(布鲁斯)。哈茨木霉菌的菌株核已经从相同的菌株或也用另一个相似物种的菌株来融入原生质体；以此
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产生混合物。
不同种类的曲霉菌及木霉菌的原生质体的融合是公认改良遗传的工业菌株技术的物种。最近,据Kumari和Panda7报道了一种里氏木霉菌和酿酒酵母属间的原生质体融合。
我们最近进行的是一项以从镰胞菌种中的丝状真菌来水解木聚糖，及木霉菌属病菌的酵母种类的毕赤酵母和里氏木酶发酵木糖基因的转移为目标的，并且病菌的物种也同样使用发酵木糖。我们已经成功构建了由原生质体融合似酵母的混合物转为水解木糖。此外，这些似酵母的混合物也保留了发酵木糖成为乙醇能力,因此可以用于发酵木聚糖直接制造乙醇。
融合物是需要使用木聚糖作为碳源和以硝酸盐作为氮源以选择性的条件来混合重获的。在融合菌株用于工业用途中，营养缺陷型的标记的使用被认为是不受欢迎的，由于营养缺陷型的转变也可以修改基因控制的主要工业中的重要特征的酵母。
我们想强调由于亲代的酵母菌种并不采用硝酸盐作为含氮源，也不会使木聚糖变形,因此它不会从木聚糖生产乙醇，同时拥有的染色体粒度范围在大多数的酵母中获得。利用硝酸盐的混合物作为一个氮源，发酵木聚糖产生乙醇,而且也有同样的大小范围中的染色体作为大多数的酵母。以取得真正的混合物。这篇论文研究结果是混合物的具有特点。 材料与方法 有机体
酵母有毕赤酵母。真菌有串株镰刀菌，赤霉病菌，镰刀菌，和尖孢镰刀菌是在宾夕法尼亚大学的研究中心，由阿根廷的安蒂奥基亚大学的S.Chulze博士进行研究的，此外里氏木酶是由阿根廷西北部沼泽地的安蒂奥基亚大学的Cuevas博士进行研究的。 栽培维护
丝状真菌维持在PDA偏含10克Lˉ1葡萄糖。毕赤酵母仍保持在YEPD琼脂含10gLˉ1酵母提取物、20gLˉ1蛋白胨，其次是20克Lˉ1葡萄糖，15gLˉ1夏甲。此外有机体以15天为一定期做培养。 丝状真菌的培养媒体
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丝状真菌的栽培介质主要是将碳源添加到20克Lˉ1葡萄糖或birchwood20克Lˉ1木聚糖的媒体中。 融合产物再生的重建媒介
在融合产物中发现了10gLˉ1木聚糖，2gLˉ1酵母提取物、0.6MKC1(作为一种渗透稳定剂)，和30gLˉ1夏甲的查氏介质。 融合产物的选择性介质
为了研究在不同的媒体中毕赤酵母与融合产物的成长能力，这些细胞被培养下列媒体：
a) C-Glu：包含20g/mL葡萄糖的查氏介质。 b) C-Xln：包含20g/mL木聚糖的查氏介质。
c) C-Xln-YE：包含20g/mL酵母膏和20g/mL木聚糖的查氏介质。 d) YNB-Xln：6.7g/mL酵母氮基（培养基）混合20g/mL木聚糖。 e) YNB-Xln-YE：6.7g /mL酵母氮基（培养基）混合20g/mL木聚糖和20g/mL酵母膏。
f) YNB-Glu：6.7g/mL酵母氮基（培养基）混合20g/mL葡萄糖。 YNB-/酵母氮基（培养基）混合20g/mL木胶糖。 在所有的介质中，琼脂浓度是20g/mL。 木聚糖酶活性测定的媒介
木聚糖酶活性是在XP-Xln介质中测定其栽培生长率(10gLˉ1酵母提取物、20gLˉ1蛋白胨和20gLˉ1木聚糖)。 发酵媒体
亲代菌株毕赤酵母，串株镰刀菌，里氏木酶与融合的产品,来测试发酵木糖和木聚糖产生乙醇的能力。 发酵媒体的合成物是：
a) YP-Xyl：10gLˉ1酵母提取物，20gLˉ1蛋白胨，和20gLˉ1木胶糖。 b) YP-Xln：10Lˉ1酵母提取物，20gLˉ1蛋白胨，和20gLˉ1木聚糖。 丝状真菌培养
为了进一步的融合来选择真菌菌株，串株镰刀菌NRRL13616，赤霉病菌NRRL5883，镰刀菌NRRL6322，尖孢镰刀菌，和氏木霉QM9441的栽培都生长
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在含有50毫升的锥型的介质与20gLˉ1木聚糖的蔡氏培养基的250毫升烧瓶里。接种的烧瓶是一种接种物，相当于7克干菌丝体体重Lˉ1介质在30°C及在200个每分钟转速的一个震动器中孵化，并定期抽样。木聚糖酶活性在每一个样品中进行测定。
真菌菌丝形成的原生质体
氏木霉和串株镰刀菌的文化是以被里长为250-ml锥形瓶烧瓶包含50毫升的察氏培养基同50克1ˉ1葡萄糖作为碳源。这些文化中被灌输1射线异物检查装置真菌孢子每毫升，18小时，在30℃并在一个以200转速旋转摇荡器孵化。菌丝体被恢复成为附近的的过滤和濯三次同无菌水。被洗净的菌丝体只能以包含0.01米二硫苏糖醇在柠檬酸盐磷酸盐缓冲血液酸碱度7.3，和孵化为1综合质量控制在30℃源文件的预处理方法。并且mycelium当时过滤桶的滤波器纸，被同一个柠檬酸盐磷酸盐洗三次，由0.7mKCl代替5.8作为一个渗透的稳定剂。生物的数量以PH值5.8，并包含0.7KC1和7mgmLˉ1 Novozym234的血小板分离术的缓冲器。KCl被添加为一个渗透的稳定剂。在30℃的悬浮物搅动在100每分钟转数为4-5小时间的最佳组合被孵化，并被监测下一个相衬显微镜。并且该通过过滤，其他的碎片，将同一个渗透洗三次，消除为菌体丝。 核分离的真菌
氏木霉的细胞核和串株镰刀菌，在4°C时，采用细胞溶解原生质体的差速离心在聚蔗糖溶液剂的作用下被分离如下：
i)原生质体培养溶液中包含了180克Lˉ1聚蔗糖，20毫米KH2PO4，钙离子，和pH值为6.5苯甲基磺酰化氟(PMSF)。该方案溶解了原生质体，而不能使核保持完整。
ii)细胞核悬浮液是处理内含有70克Lˉ1聚蔗糖，20毫米KH2PO4，0.5毫米钙离子，1毫米PMSF，1米山梨醇、和200克Lˉ1甘油在核心净化的溶液。
最终的净化颗粒重新分散在0.5毫升的溶液.所提到的步骤二和使用酵母原生质体使核立即融合。在荧光显微镜下，观察到孤立的细胞核被DAPI沾满。 酵母的原生质体与丝状真菌的核的融合
酵母原生质体通过标准的方法获得。原生质体被重新分散在0.4米CaCl2的0.5毫升溶液，并与细胞核悬浮液混合，在10分钟內分离在12000g。上清液被
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抛弃，同时颗粒重新分散到融合的混合物中。悬浮液在25°C待10分钟并被孵化。 融合产物的再生
熔液添加到稳定渗透，在42°C下，融化再生介质，混合、倒作为一种叠加在相同的再生的介质中，并使其变硬。在30°C下孵化4-5天，直到似酵母的细菌出现。这些细菌被转移到选择性媒体C-Xln-YE中来分离理想的融合产物的特性。似酵母的细菌在C-Xln-YE介质上生长，并面临选择。 木聚糖酶活性的测定
似酵母的混合物和丝状真菌的亲代菌株在YP-Xln介质被培养。定期测定木聚糖酶活性；这是在上清液确定为似酵母的混合物和通过二硝基水杨酸方法对丝状真菌过滤。木聚糖酶活性，表现在nkat每毫升。 发酵试验
发酵试验，毕赤酵母和似酵母混合物分别在YP-Xyl和YP-Xln媒体，并以24小时的周期，120-144小时间在30°C的丝状真菌与最少的搅拌，在介质里允许少量的氧气进行的。定期采样培养。乙醇和木糖的浓度由高效液相色谱法和高效液相色谱法测定木聚糖的苯酚/硫酸的方法所决定。 脉冲场凝胶电泳
电泳的分析执行是通过使用基于CHEF技术的CHEFDRII系统。琼脂插头依据前述方法准备。凝胶是在0.5X电脉缓冲液下，使用1%染色体品位的琼脂。脉冲周期在12小时到60小时间，在125-450脉冲中转换，并分别在0.5X电脉缓冲液下在14°C的缓冲区被用来分离染色体。 研究结果
为了在融合时，选择作为亲代的真菌菌株。不同真菌菌株(见材料和方法)的分批培养物都生长在C-Xln介质中，并在30°C温度下，在旋转摇荡器以200每分钟转速进行操作。在七天中，样品每隔12小时被拿出来。并对木聚糖酶活性进行了测定。
氏木霉和串株镰刀菌表现出最高的木聚糖酶活性(表1),并用他们的核和毕赤酵母的原生质体的得以融合。
在分析这些检测中的酵母原生质体的构造是在显微镜下进行比较，监测的。原生质体维持在一个稳定渗透的溶液里,随后被当作是一种亲代菌株与两种真菌
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