Clusterin在庆大霉素诱导的急性肾损伤大鼠模型中的表达
及诊断意义
耿嘉男，孙 波，刘 凯，陈艳芳，刘 畅，雷冬艳，石 艳，于晓艳＊ 【期刊名称】中国实验诊断学 【年(卷),期】2014(000)007 【总页数】2
Clusterin是体内一种异二聚体糖蛋白，最初见于公羊睾丸液，作用为促细胞聚集。其后陆续研究发现Clusterin参与许多重要生理过程：细胞周期调控、DNA的损伤修复和组织修复等，具有辅助生殖、脂质转运、抑制补体介导的细胞免疫等功能［1］，还与调控细胞凋亡有关［2］。为进一步明确尿中Clusterin水平与在急性肾损伤中的诊断意义［3，4］，本研究建立大鼠庆大霉素急性肾损伤模型，动态监测大鼠尿液中Clusterin的分泌水平，观察其与肾脏病理形态学改变的关系，为将尿液Clusterin含量检测应用于无创性肾损伤诊断提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
小鼠抗Clusterin单克隆抗体购自R＆D公司，通用型二步法免疫组化试剂盒（PV－6000）和DAB显色剂购自北京中杉生物技术有限公司，庆大霉素购自Sigma公司。
1.2 实验动物及建立模型
40只雄性Wister大鼠（体重180－220g，由吉林大学实验动物中心提供），适应性饲养1周，大鼠造模前禁食12h后皮下注射庆大霉素（GM）
400mg·kg·d，连续注射2天，建立GM中毒性急性肾小管坏死（ATN）动物模型，对照组大鼠皮下注射生理盐水代替庆大霉素。大鼠置代谢笼每天收集尿液，共收集10天，置－80℃保存备用；分别于第0d、1d、 3d、5d和第9d取模型大鼠肾脏备用。
1.3 ELISA检测大鼠尿液Clusterin水平
大鼠尿液离心后取上清，尿样按85μl包被液＋15μl样品比例加入96孔酶标板，4℃包被过夜；次日每孔加入150μl 1%BSA置37℃条件下封闭1h，洗板3次×3min，然后加入小鼠抗Clusterin单克隆抗体（1∶1000稀释）100μl／孔，37℃孵育1h；洗板，加入羊抗小鼠二抗（1∶3 000稀释）100μl／孔，孵育1h；采用邻苯二胺－过氧化氢显色系统进行显色，置37℃避光显色10min后终止反应，经酶标仪检测A490值。 1.4 免疫组化检测大鼠肾脏Clusterin表达
大鼠处死后取肾脏，于10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋，切片；切片经脱蜡、水化，微波热修复，冷却后经3% H2O2灭活内源性过氧化酶；Clusterin一抗以1∶100稀释后加入，4℃孵育过夜，滴加二抗以及染色步骤严格按照PV－6000说明书操作。Clusterin蛋白阳性染色见于胞质，阳性细胞染色程度按0－3分计算：0分，阳性细胞表达＜10%；1分，阳性表达占11%－25%；2分，阳性表达占26%－50%；3分，阳性表达≥50%［5］。染色后同时观察肾小管间质病理改变。 1.5 统计学分析
实验数据以均数±标准差（ˉx±s）表示，采用SPSS 19.0统计软件对数据进行分析，组间比较采用方差分析，P＜0.05时视为有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠尿液中Clusterin表达
经检测大鼠造模第0d尿液即正常尿液Clusterin的A490值为0.56±0.25，造模后第1－2d尿液中Clusterin即有所增高（依次为0.64±0.21和0.72±0.30），但无明显统计学意义，表明大鼠造模后1－2d尿液中Clusterin即开始有所表达，自造模后第3－7d尿液中Clusterin均较正常尿液表达明显升高（依次为0.82±0.31、0.94±0.29、0.94±0.31、0.94±0.28、0.87±0.36），造模后第8d尿液Clusterin含量有所下降（0.75±0.28），但仍维持在较高水平，造模后第9d尿液Clusterin含量下降近正常水平（0.56±0.22）。结果表明给大鼠予庆大霉素后1－2d尿液中Clusterin即开始出现，第3d开始含量明显增加，第4－6d达到高峰，第7－8d开始Clusterin含量趋于下降，但仍高于正常水平，造模后第9d尿液Clusterin含量接近正常。 2.2 各组大鼠肾脏病理学检查
细胞质呈现黄色颗粒即为Clusterin蛋白阳性表达，免疫组化结果显示：正常组大鼠肾脏无明显病理改变，无明显Clusterin蛋白表达，免疫组化评分为0分；造模成功后1d Clusterin偶有表达，评分为1分，病理可见炎症细胞浸润；第3d、5d时Clusterin表达最多，评分为3分，肾间质炎症细胞浸润明显，可见肾小管上皮细胞坏死、塌陷，肾间质明显增宽，间质水肿明显；第9d时炎症细胞浸润有所减轻，Clusterin表达开始减少，评分为2分，见图1。
3 讨论
急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是可发生在各种临床情况下的一种复杂的肾功能减退综合征，2013年3月14第八个世界肾脏日就提出“关注
Clusterin 在庆大霉素诱导的急性肾损伤大鼠模型中的表达及诊断意义
