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细胞和分子遗传学 第一章 绪论
1. 遗传：生物信息从上代往下代传递 2. 遗传学：研究遗传规律的科学
3. 基因组Genome : 一整套染色体上的所有遗传物质
4. 基因组学Genomics: 研究基因组的科学，包括研究分析核酸序列、基因成分、基因结构和基因数目.
5. 细胞遗传学: 从细胞学和遗传学发展起来的交叉学科，它涉及染色体的形态、结构、数目、功能和运动等特征，以及这些特征的各种变异对遗传传递、重组、表达与调控的作用和影响，也涉及染色体外的遗传因子。以染色体遗传为研究核心。 6. FISH(fluorescent in situ hybridization):荧光原位杂交
7. 原位杂交：是一项利用标记的DNA或RNA探针直接在染色体、细胞或组织水平定位特定靶核酸序列的分子细胞遗传学技术。
8. FISH工作原理：用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特性高和可以多重染色等特点。
9. FISH的应用：⑴位点特异性探针：能与染色体的特定部位杂交；已经分离出一段基因的一小部分，若要确定这段基因位于哪个染色体，就准备这段基因的探针并观察该探针与哪个染色体杂交。⑵整个染色体探针：能分别与染色体纵轴的不同序列杂交的很短的探针的集合。用这些探针库能画出全部染色体并产生核型谱带，再进行核型分析，用于检测染色体异常 10.原位杂交的种类：⑴GISH（Genomic in situ hybirdization)——以基因组为探针（整个染色体）。⑵FISH（Fragment in situ hybridization)——以特定的基因为探针（基因片段）。⑶mFISH (multicolor FISH)——利用不同颜色的荧光素标记不同的探针。⑷Fiber-FISH——利用化学方法对染色体进行线性化，再以此线性化的染色体DNA纤维为载体进行FISH（提高分辨率）。 第二章 基因组作图与基因定位
1. 结构基因组的研究策略：测序路线——作图（遗传图和物理图）、测序（图谱测序和随机测序）、组装（骨架图和空隙图）。
2. 为何要绘制遗传图与物理图？1)基因组太大,必需分散测序,然后将分散的顺序按原来位
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置组装,需要图谱进行指导. 2)每次仅能读取1000bp，已知最小的细菌为580kb.3)基因组存在大量重复顺序,会干扰排序,因此要高密度基因组图. 4)遗传图和物理图各有优缺点,必须相互整合校正.
3. 遗传图与物理图：⑴遗传作图（Genetic mapping）采用遗传学分析方法将基因或其它DNA顺序标定在染色体上构建连锁图。包括杂交实验，家系分析。遗传图距单位为厘摩(cM), 每单位厘摩定义为1%交换率。⑵物理作图（Physical mapping）采用分子生物学技术直接将DNA分子标记、基因或克隆标定在基因组实际位置。物理图的距离依作图方法而异，如辐射杂种（radiation hybrid）作图的计算单位为厘镭(cR), 限制性片段作图与克隆作图的图距为DNA的分子长度，即碱基对(bp, kb)。
4. 基因组测序的策略：Clone-by-clone测序（基因克隆）、鸟枪法测序（全基因组）、混合法测序。基本流程：随机酶切成小片段（不完全酶切）——亚克隆（酶切片段+载体）——亚克隆测序（两端测序）——组装。关键：酶选择，片段大小，数量（库大小）。
5. 基因组路标(landmarker)：染色体上的基因和DNA顺序均可作为路标, 路标具有物理属性,他们由特定的DNA顺序组成. 路标位于染色体上的位置是固定的, 不会更改的, 因而提供了作图的依据。
6.RFLP（restriction fragment length polymorphism，限制性片段长度多态性）：指基因型之间限制性片段长度的差异（同种酶），这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。
7. RFLP的特点：⑴处于染色体上的位置相对固定; ⑵同一亲本及其子代相同位点上的多态性片段特征不变; ⑶同一凝胶电泳可显示不同多态性片段, 表现为共显性（双亲的性状同时在F1个体上表现出来）——一个酶切位点突变，则两条同源染色体跑出的胶共有3段，下面两段相加等于上面那段.
8. 如何寻找RFLP标记（即酶切位点）: ⑴随机克隆筛选; ⑵将其它方法获得的DNA标记, 如RAPD (random amplified polymorphism DNA)标记转换为RFLP标记; ⑶从cDNA 中寻找RFLP. ⑷计算机筛选.
9. AFLP(amplified fragment length polymorphism, 放大的片段长度多态性)：⑴这是一种筛选RFLP分子标记的方法. 先将DNA样品采用选定的限制性内切酶(如EcoRI, Sau3A)消化, 然后加上接头PCR引物（补平粘性末端并额外延伸1-3个碱基）. ⑵接头PCR引物设计: 根据限制酶接头添加数个向外延伸的碱基（补平末端）, 然后向3’方向延伸1-3个不同的碱基（共有41-43种不同的引物）. ⑶选择不同的引物对扩放样品DNA（PCR）, 经聚丙烯胺
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凝胶电泳分离标记的（就是用那多出的1-3个碱基作为标记）PCR产物.
10.SSLP（simple sequence length polymorphism，简单序列长度多态性）：⑴可变排列的简单重复顺序, 即重复次数不一, 在染色体的同一座位重复顺序拷贝数不同(导致多态性); ⑵SSLP的类型:小卫星序列(minisatellite), 重复单位较长；微卫星序列(microsatellite), 重复单位较短, 在1-6个核苷酸之间。
11.SSR（简单重复序列，即微卫星序列）: 其串联重复的核心序列为1-6 bp，其中最常见是双核苷酸重复(CA,TG), 重复单位数目10-60个。
12. 如何寻找微卫星序列标记? ⑴1982年Hamada等首次报道microsatellite现象(PNAS, 79:6564, 1982)。⑵1989年Weber等从GenBank中发现人类基因组的8个位点中, 有7个位点存在(CA)n拷贝数的变化(Am. J. Hum. Genet., 44:388, 1989).⑶现已证实人和老鼠基因组中平均每18-28 kb含有一个多态性(CA)n.⑷获取方法: a) 机算机搜寻; b) 用Sau3A, RsaI, HaeIII或AluI 限制酶酶切基因组DNA, 构建DNA文库.合成简单寡聚重复核苷酸作为探针从库中筛选.⑸根据简单重复顺序两侧的序列设计引物, 用同位素标记PCR扩增样品, 经聚丙烯酰胺凝胶电泳分辩.
13. SNP (single nucleotide polymorphism,单核苷酸多态性)：指在基因组上单个核苷酸的变异,包括置换、颠换、缺失和插入，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。
14. SNP的一些特点：⑴理论上同一碱基位置SNP等位型式最多为4. ⑵直接从STS (sequence-tagged site，序列标志位点)测序中可寻找到SNP. ⑶ MIT Whitehead Institute 经分析证实, 人类基因组平均每1 kb 含有一个SNP. 估计人类基因组有300万个SNP. ⑷SNP与人类易感性疾病有关, 涉及药物基因组学. ⑸编码区SNP主要分布在密码子的摇摆位置（第3个碱基），表现为沉默突变而被保留下来.
15. ★遗传图绘制-分子标记的等位型式及F2基因型分析，计算重组率，从而绘制遗传图（Aa/Bb，其中A/B连锁）（图-42）
16. ★物理图绘制：⑴限制性作图（Restriction mapping）它是将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置。⑵依靠克隆的基因组作图(Clone-based mapping) 根据克隆的DNA片段之间的重叠顺序构建重叠群(Contig), 绘制物理连锁图。⑶荧光标记原位杂交（Fluorescent in situ hybridization, FISH）将荧光标记的探针与染色体杂交确定分子标记的所在位置。⑷顺序标签位点（Sequence tagged site, STS）作图通过PCR或分子杂交将小段DNA顺序定位在基因组的DNA区段中（小段DNA序列已知，两端设计引物，利用PCR进行扩增）。 ㈠ 限制性作图（Restriction mapping）：将限制性酶切位点标定在DNA分子（一般为小分子
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DNA）的相对位置。⑴酶切片段电泳图；⑵推测出限制性物理图。
对于大分子DNA的研究策略与方法：1) 制备---琼脂糖包埋法 2) 酶切---稀有酶切位点限制酶 3) 分离---脉冲电泳分离 4) 克隆---载体设计
①琼脂糖包埋法(知道即可)：a.分离纯化细胞核 b.将收集的细胞核包埋在琼脂糖凝胶薄片中 c.蛋白酶消化处理细胞核。 ②稀有切点限制性内切酶的应用：a.什么是稀有切点内切酶： 在基因组DNA顺序中有很少可识别序列的限制酶, 一般识别位点在6-8碱基对之间, 并含有高G/C比。 b.选用稀有切点限制酶注意事项：a) 识别位点的非特异顺序, -G ANTC- (HinfI), -GCCN4 NGCC- (BglI) b) 高等生物基因组一般A/T比较高, 应选G/C高比例限制酶, 如-GC GGCCGC-(NotI) c) 基因组甲基化状态, 高等生物基因组DNA甲基化比例很高, 但果蝇和酵母基因组无甲基化。③脉冲交变电场电泳：会跑出一段白色的轨迹，而不是一条一条的片段（因为各片段紧密相连，共同组成了连成一片的轨迹）。
㈡ 克隆作图（大分子DNA的克隆）：根据克隆的DNA片段之间的重叠顺序构建重叠群(Contig), 绘制物理连锁图。
克隆作图的载体与方法：⑴大分子DNA克隆载体构建：YAC, BAC, PAC, HAC, MAC, TAC。⑵大分子DNA克隆的作图：步移法和指纹法。
①YAC（酵母人工染色体）和BAC（细菌人工染色体）基因组文库的构建：1) 目标基因组大分子DNA的制备 2) 载体制备3) 载体和插入DNA的连接 4) 转化 5) 转化子鉴定 ②染色体步移法：以A1为探针，找到B1、B2（A1两端与B1、B2分别配对），在分别以B1、B2为探针重复杂交，筛选到下一轮阳性克隆C1、C2，不断重复，建立起彼此连接的重叠群。
③限制性片段指纹作图原理：a.在两个重叠BAC克隆间存在相同指纹 b.重叠BAC克隆DNA凝胶电泳指纹图（重叠的片段在图上显出相同位置的条带）：BAC克隆酶切后经过琼脂糖凝胶电泳分离，染色后显示片段指纹，再经计算机识别相同的指纹区段，即重叠的BAC克隆。最后构建指纹重叠群（物理图的绘制），基因组的遗传图可与物理图整合。
㈢顺序标签位点（Sequence tagged site, STS）作图：通过PCR或分子杂交将特定DNA 顺序定位在基因组染色体区段中。
STS作图原理：将染色体DNA随机打断，两个标记所处的物理位置越近，位于同一片段的几率越高。①辐射杂种作图: 辐射杂种图距单位——DNA分子暴露在N拉徳(rad) X射线剂量下两个分子标记之间发生1%断裂的机率, 其图距单位为厘镭(centiRay, cR).②③ 17.物理图的应用——图位克隆或定位克隆：该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的
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位置进行的,无需预先知道基因的DNA 顺序,也无需预先知道其表达产物的有关信息（遗传作图→物理作图→转录图→基因顺序）。1) 首先找到与目标基因紧密连锁的分子标记; 2) 用遗传作图和物理作图将目标基因定位在染色体的特定位置; 3) 构建含有大插入片段的基因组文库(BAC库或YAC); 4) 以与目标基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库; 5) 用获得的阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群; 6) 通过染色体步行、登陆或跳跃获得含有目标基因的大片段克隆; 7) 通过亚克隆获得含有目的基因的小片段克隆; 8) 通过遗传转化和功能互补验证最终确定目标基因的碱基序列。（百科）
18. ★图位克隆的步骤：1) 连锁标记的分离与克隆（筛选到）; 2) 连锁标记向靶基因位置逼近; 3) 以紧密连锁标记为探针筛选基因组(大插入片段)克隆; 4) 染色体步移, 构建覆盖靶基因位点的重叠群; 5) 以覆盖靶基因位点的DNA克隆为探针从cDNA文库筛候选基因; 6) 候选基因多态性分析; 7) 转基因验证. 第三章 基因组测序与诠释
1.本章内容：①基因组测序的策略 ②基因组测序的方法 ③高通量自动化测序 ④序列组装 2.基因组测序的策略：①随机测序 ②限定测序
3.随机测序（与鸟枪法类似）：①基因组文库的构建 ②两端测序（基因组DNA→部分酶切→电泳分离→DNA片段建库→挑取克隆→两端测序→形成重叠群→覆盖的DNA区段可得到）
4.基因组测序的方法：①测序的DNA多聚酶 ②测序标记 ③电泳装置 ④测序难点. 5. 测序的DNA多聚酶：①高酶活性; ②无5’→3’外切核酸酶活性; ③无3’→5’外切核酸酶活性。
6. 链终止法测序(Sanger法)：和放射性同位素标记测序法不同——①以荧光颜色为标记信号,每种ddNTP各有1种代表颜色; ②整个反应在一个试管中进行; ③新合成的终止单链通过荧光监测仪时,可以光信号读出末端核苷酸并由电脑记录.
7. 化学法测序(Maxam法)：①分别修饰分别降解; ②试剂含有毒性; ③链终止法更易于自动化.
8．毛细管电泳：取代聚丙烯酰胺凝胶电泳，有96个泳道，可同时进行96次测序，每轮不到2小时，一天近千次反应
9. 几种不同生物基因组的测序：1) 大肠杆菌基因组测序----图位法 2) 流感嗜血杆菌基因组测序---鸟枪法 3) 果蝇基因组测序---鸟枪法4) 人类基因组测序---图位法和鸟枪法（鸟枪法局限：无法测到重复出现的DNA片段）5) 拟南芥基因组测序—图位法 6) 水稻基因组测序
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细胞与分子遗传学
