何首乌蒽醌类提取和分离

何首乌蒽醌类化学成分的提取和鉴别

何首乌是常用补益中药, 来源于蓼科植物何首乌的干燥块根。中医药认为, 何首乌味苦、涩, 性温。归肝、心、肾经。生用解毒消痈, 润肠通便; 制用补肝肾, 益精血, 乌须发, 强筋骨。含游离蒽醌类衍生物约1.1%，大部分与葡萄糖结合成苷现代研究表明, 何首乌具有降血脂、延缓动脉粥样硬化、抗衰老、提高免疫力、益智等作用。（王文静, 薛咏梅,等.何首乌的化学成分和药理作用研究进展[ J ].云南中医学院报，2007，1000—2723）,

何首乌为蓼科植物何首乌Polygonum multiflo-rumThunb.的干燥块根,为常用中药。现代研究发现何首乌含有二苯乙烯苷类、蒽醌类、黄酮类等多种成分[1],具有抗衰老、增强免疫力、抗菌、调血脂等多方面的药理作用[2]。我国植物资源丰富,分布于东北、中南、华东、西南各省。国内外学者对四川和广东产的何首乌进行了较多的研究,为了更好的开发和利用植物资源,进一步寻找活性成分,笔者对采自泰山的何首乌化学成分进行了系统的研究,从中得到9个蒽醌类化合物,分别鉴定为大黄素(emodin,Ⅰ)、大黄素甲醚(physcion,Ⅱ)、拟石黄衣醇(迷人醇,fallacinol,Ⅲ)、大黄素-8-甲醚(questin,Ⅳ)、桔红青霉素(emodin-6,8-dimethylether,Ⅴ)、ω-羟基大黄素(citreorosein,Ⅵ)、大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(emodin-8-O-β-D-glucopyranoisde,Ⅶ)、大黄素-8-O-(6′-O-乙酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷[emodin-8-O-(6′-O-acetyl)-β-D-glucopyranoside,Ⅷ]和大黄素甲醚-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(physcion-8-O-β-D-glucopyranoside,Ⅸ)。化合物Ⅴ为首次从该科植物中分得,化合物Ⅲ和Ⅷ为首次从该种植物中分得。

1.何首乌化学成分

何首乌含蒽醌类化合物,主要成分是蒽醌类成分（大黄素、大黄酚、大黄酸、大黄素甲醚、大黄素蒽酮等）、二苯乙烯苷类,此外尚含有卵磷脂、粗脂肪、多糖类、黄酮类、游离氨基酸及多种微量元素等。（崔映宇, 李焰焰 何首乌研究进展[ J ].阜阳师范学院学报(自然科学版)，2004，1004-4329 (2004) 04-0024-04） 1.1 蒽醌类化合物

何首乌中蒽醌主要为大黄素 分子式C5H10O5，分子量为270.23。橙色针状结晶（乙醇）。几乎不溶于水，溶于乙醇及碱溶液。

大黄酚 分子式C15H10O4，分子量为254.23。升华，橙黄色片状结晶，几乎不溶于水，略溶于冷乙醇，溶于苯、冰醋酸、三氯甲烷、丙酮等，极微溶于石油醚。

大黄素甲醚 分子式C16H10O5，分子量为284.26。砖红色单斜针状结晶。溶于苯、三氯甲烷、吡啶及甲苯，微溶于乙酸乙酯，不溶于甲醇、乙醇、乙醚、丙酮。与乙酸镁试剂反应显橙红色或粉红色。

大黄酸 分子式C15H8O6，分子量为284.21。黄色针状结晶（升华法）。几乎不溶于水，溶于碱和吡啶，略溶于乙醇、苯、三氯甲烷、乙醚和石油醚。 此外还有芦荟大黄素、大黄素苷、大黄素甲醚苷等。 何首乌中含蒽醌类化合物约1.1%。《中国药典》2010年版增加何首乌中结合蒽醌作为何首乌鉴定的第2 个指标性成分，结合蒽醌以大黄素和大黄素甲醚的总量计，不得少于0.10%。蒽醌类成分具有降血脂、抗动脉粥样硬化、抗菌、润肠通便等药理作用。蒽醌类化合物中多具有羧基、酚羟基酸性基团，故具酸性。由于所具有的酸性基团种类、数目及位置不同，其酸性强弱也有一定差异，规律为：-COOH>2β-OH>1β-OH>2α-OH>1α-OH,因此可以用PH梯度法进行蒽醌类化合物的分离纯化，即用5%NaHCO3、5%Na2CO3、1%NaOH溶液进行梯度萃取。（方红玫，朱延焱 何首乌有效成分毒性作用和相关研究进展[ J ]. 国际药学研究杂志，2010，

1674-0440（2010）04-0283-04） 1.2 二苯乙烯苷类化合物

何首乌中含有大量的2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（2，3，5，4′-tetrahydroxy-silbene-2，3-O-β-D-glucoside），为白色无定形粉末，它具有良好的水溶性，易溶于水、甲醇、乙醇。具有抗氧化清除自由基，降低胆固醇，保肝等多重功能，作为抗衰老的标的组分极具研究的价值。二苯乙烯苷在水溶液中较稳定，但高温对其有一定影响，在酸性溶液中很不稳定。这类化合物又称二苯乙烯苷类化合物，《中国药典》2010 年版规定本品含此种成分不得少于1.0%。何首乌中二苯乙烯苷类化合物是保肝的一种有效成分，这种成分中所含的二苯烯成分对过氧化脂质和单胺氧化酶（MAO）含量上升、血清谷丙转氨酶（ALT）与谷草转氨酶（AST）升高等有显著对抗作用，还能使血清游离脂肪酸显著下降。（方红玫，朱延焱 何首乌有效成分毒性作用和相关研究进展[ J ]. 国际药学研究杂志，2010，1674-0440（2010）04-0283-04） 1.3 磷脂类

何首乌中含丰富的磷脂类成分，含量约为0.15%～0.30%，包括卵磷脂、肌醇磷脂、乙醇胺磷脂、磷脂酸、心磷脂等，其中以卵磷脂含量较高，约占30%~40%。可溶于脂肪烃、芳香烃、 卤化烃类有机溶剂，如乙醚、苯、三氯甲烷、石油醚等。它只部分溶于脂肪族的醇类，如乙醇。像其它非极性的表面活性剂一样，不溶于极性的溶剂，如乙酸甲酯，尤其是丙酮；但在有少量油脂存在时，磷脂乙丙酮和乙酸甲酯中的溶解度即增加。卵磷脂可溶解于乙醇中。利用磷脂在溶剂中溶解度的差异，可作为分离、提纯及定量磷脂的依据。磷脂类成分是首乌补益作用的物质基础。何首乌抗氧化，延缓衰老等药理作用与何首乌中卵磷脂等物质基础分不开。（方红玫，朱延焱 何首乌有效成分毒性作用和相关研究进展[ J ]. 国际药学研究杂志，2010，1674-0440（2010）04-0283-04） 1. 4 其他成分

何首乌还含有其他成分——何首乌乙素、丰富的黄酮类成分、多酚类成分、多糖、以及微量元素与矿物质等。（方红玫，朱延焱 何首乌有效成分毒性作用和相关研究进展[ J ]. 国际药学研究杂志，2010，1674-0440（2010）04-0283-04） 2.1蒽醌类提取和分离

2.2.1总蒽醌类的提取方法

方法一：有机溶剂提取法：游离醌类的极性小，可用极性小的有机溶剂提取。苷类极性较苷元大，故可用甲醇、乙醇和水提取。例如，取大黄粗粉 150g, 置于 1000ml 的园底烧瓶中，加乙醇回流提取三次，第一次加 95% 乙醇 500m1,回流一小时，第二次加 95% 乙醇 300 ml，加流半小时，第三次加 95% 乙醇250 ml，回流半小时，趁热过滤，合并三次乙醇提取液，放置后，如有沉淀可再过滤一次； 滤液减压回收乙醇至糖浆状，即为乙醇总提取物；趁热转移至 250ml 的三角烧瓶中备用。

方法二：碱提酸沉法：用于提取具有游离酚羟基的醌类化合物，酚羟基与碱成盐而溶于碱水

溶液中，酸化后酚羟基游离而沉淀析出。

方法三：水蒸气蒸馏法:由于小分子的游离醌类化合物具有挥发性，可随水蒸气蒸馏出，所

以适应于分子量小的具有挥发性的苯醌及萘醌类化合物。

2.2.2 PH梯度萃取法提取·分离流程

杨同成就蒽醌类成分酸性不同的特点，将何首乌粉用20%硫酸-氯仿混合液回流提取后，利用2.5%碳酸氢钠，2.5%碳酸钠，0.5%氢氧化钠进行PH梯度萃取，然后加入Hcl酸化沉淀，水洗沉淀并用冰醋酸重结晶，得蒽醌衍生物结晶，并通过加碱显色定性分析，薄层分析，硅

胶柱层析，熔点测定，红外光谱分析鉴定，得沉淀为羟基蒽醌类衍生物。（杨同成何首乌蒽醌衍生物的提取及其抗白发作用机制初探[ J ]. 福建师范大学学报 1993 9（2）:66-69 ） 罗艳将何首乌用4倍量70%重复回流提取1h，提取液浓缩成膏状，分别用环己烷，乙酸乙酯，正丁醇对浸膏进行萃取，将萃取液浓缩得浸膏。向乙酸乙酯浸膏内加入2倍量硅胶拌样，以6.9cm×120cm玻璃层析柱，200-300目硅胶，按石油醚，乙酸乙酯，甲醇的极性由低到高梯度洗脱，的58个流分，经TLC检查，荧光和理化方法显色，纯化得七个化合物。经波普解析，得出他们分别为大黄素甲醚，大黄素，大黄素-8-甲醚，β-谷甾醇，没食子酸，胡萝卜苷和GXHSWAQ-1.（罗艳 广西何首乌蒽醌化合物的分离提取及GXHSWAQ-1对鼻咽癌放射增敏作用的研究 广西医科大学硕士研究生学位论文 2007）

何首乌粉末 苯-20%硫酸（5：1）提取三次 提取液 浓缩，放置过夜，过滤 母液 粗结晶 分别以2.5%碳酸氢钠溶液，2.5% 苯洗涤，苯-乙酸乙脂

碳酸钠溶液和1%氢氧化钠溶液萃取 重结晶2次

红橙色结晶（大黄素） 碳酸氢钠溶 碳酸钠溶液 氢氧化钠溶液 酸化至PH约2-3 同左 同左 三氯甲烷萃取

三氯甲烷液 三氯甲烷液 三氯甲烷液 浓缩，放置过夜 同左 同左 过滤 红橙色结晶 红橙色结晶

同左 同左

红橙色结晶 混合结晶 橙黄色结晶

苯洗涤，苯-乙酸乙酯 苯溶解，硅胶柱色谱， （大黄素-6-甲醚） （4:1）重结晶 苯，乙醇依次洗脱 红橙色结晶 （大黄素）

大黄素-6-甲醚 4个蒽醌 大黄素（宋小妹，唐志书 中药化学成分提取分离与制备第2版 人民卫生出版社）

2.2.3色谱法提取与分离

何首乌湿质量25 kg,切片晒干后约10 kg,粉碎,90%乙醇渗漉4次,合并渗漉液,浓缩至无醇味,得到总浸膏约1 kg,将浸膏混悬于水中,依次用氯仿、醋酸乙酯、正丁醇萃取,得到3部分浸膏。取氯仿萃取物116 g经200~300目硅胶柱色谱,石油醚-醋酸乙酯(50∶1~1∶2)梯度洗脱,500 mL收集一份,合并相同流份,流份18~23经醋酸乙酯重结晶得到化合物Ⅱ(0.3 g);流份

77~100 (3.4 g)硅胶柱色谱,石油醚-醋酸乙酯(10∶1~8∶1)梯度洗脱分成4个部分,第4部分(1.1 g)经Sephadex LH-20纯化(以氯仿-甲醇1∶1洗脱)得到化合物Ⅴ(30 mg);流份130~162经氯仿-甲醇重结晶得到化合物Ⅰ(0.4g);流份169~191(0.7 g)硅胶柱色谱,以石油醚-丙酮(5∶1)洗脱得到化合物Ⅲ(15 mg);流份207~226硅胶柱,石油醚-丙酮(5∶1)洗脱,以10 mL试管收集,将第9~13管(0.3 g)经Sephadex LH-20纯化(以氯仿-甲醇1∶1洗脱)得到化合物Ⅳ(80 mg)。取醋酸乙酯萃取物425 g经200~300目硅胶柱色谱,氯仿及氯仿-甲醇(5%~100%)梯度洗脱,10%甲醇洗脱部分(1.1 g)硅胶柱色谱,氯仿-甲醇(20∶1~1∶1)梯度洗脱,约100 mL收集一份,合并相同流份,由第5部分再次硅胶柱色谱,以氯仿甲醇(20∶1)洗脱得到化合物Ⅵ(15 mg);15%甲醇洗脱部分(9.8 g)硅胶柱色谱,氯仿-甲醇(10∶1~1∶1)梯度洗脱,5∶1洗脱部分得到化合物Ⅶ(0.25 g),7∶1洗脱部分(1.7 g)硅胶柱色谱,氯仿-甲醇(25∶1~5∶1)梯度洗脱,约100 mL收集一份,合并相同流份,第8部分(0.2 g),再次硅胶柱色谱,以氯仿-甲醇(20∶1)洗脱得到化合物Ⅷ(20 mg);第9部分(0.5g),硅胶柱色谱,以氯仿-甲醇(10∶1)洗脱,约100mL收集一份,合并相同流份,取第4部分(0.2 g)经Sephadex LH-20纯化(以氯仿-甲醇1∶1洗脱)得到化合物Ⅸ(25 mg)。 结构鉴定

化合物Ⅰ:黄色针晶(氯仿-甲醇),mp 260.2~260.6℃。Borntrager′s反应阳性,示可能为羟基蒽

醌类化合物。IR、ESI-MS、1H-NMR数据与文献一致[3],确定该经合物为大黄素。

化合物Ⅱ:淡黄色针晶(醋酸乙酯), mp206.9~207.2℃。Borntrager′s反应阳性,示可能为羟基蒽

醌类化合物。IR、ESI-MS、1H-NMR数据与文献一致[3],确定该化合物为大黄素甲醚。

化合物Ⅲ:黄色针晶(氯仿-甲醇)。IRνKBrmax(cm-1):3 331(OH),1 674(未缔合C=O伸缩振

动),1 628(缔合C=O伸缩振动),1 566(芳环)。ESI-MSm/z:301.0(M++1,基峰)。1H-NMR(Ace-tone)δ:4.02(3H,s,OCH3),4.65(1H,t,J=5.8Hz,OH),4.80(2H,d,J=6.1Hz,OCH2),6.82(1H,d,J=2.3Hz,H-7),7.31(1H,d,J=2.2Hz,H-5),7.34(1H,s,H-2),7.79(1H,s,H-4),12.10(1H,s,α-OH),12.26(1H,s,α-OH)。以上1H-NMR数据与文献一致[4],确定该化合物为拟石黄衣醇。

化合物Ⅳ:黄色针晶(甲醇),mp 293.8~296.8℃。Borntrager′s反应阳性,示可能为羟基蒽醌类化

合物。IR、ESI-MS、1H-NMR数据与文献一致[5],确定该化合物为大黄素-8-甲醚。

化合物Ⅴ:桔红色针晶(石油醚-醋酸乙酯),mp211.0~213.0℃。IRνKBrmax(cm-1):3 420(OH),1

630(C=O伸缩振动),1 593(芳环)。ESI-MSm/z:299.1(M++1,基峰)。1H-NMR(DMSO-d6):2.41(3H,s,CH3),3.97(3H,s,OCH3),3.98(3H,s,OCH3),7.01(1H,d,J=2.3Hz,H-7),7.29(1H,d,J=2.4Hz,H-5),7.14(1H,s,H-2),7.45(1H,d,J=0.8Hz,H-4),13.08(1H,s,α-H)。1H-NMR数据较化合物Ⅳ在δ56.7多一甲氧基,表明有两个甲氧基取代。在NOESY谱中,H-7和H-5都与甲氧基相关,而H-2与甲氧基无相关,表明两个甲氧基的取代位置为6,8-二取代。1H-NMR数据也与文献的6,8-取代者相同[6],而有别于1,6-取代者。确定该化合物为大黄素-6,8-二甲醚.

化合物Ⅵ:黄色针晶(氯仿-甲醇)。IR、ESI-MS、1H-NMR数据与文献一致[7],确定该化合物

为桔红青霉素。

化合物Ⅶ:黄色针晶(氯仿-甲醇),mp 186.5~187.5℃。Borntrager′s反应酸水解呈红色,示可能

为羟基蒽醌苷。IRνKBrmax(cm-1):3 424(OH),1 670(未缔合C=O伸缩振动),1 626(缔合C=O伸缩振动),1 596(芳环)。ESI-MSm/z:271.0(M+-glc+1,基峰)455.0(M++Na).1H-NMR(DMSO-d6)δ:2.41(3H,s,CH3),3.24~3.74(6H,m,糖上6个H),4.53(1H,t,J=5.6 Hz,糖上C6-OH),4.97~5.02(3H,m,糖上C2~4-OH),5.05(1H,d,J=7.6 Hz,糖上端基H),7.02(1H,d,J=2.4 Hz,H-7),7.30(1H,d,J=2.4 Hz,H-5),7.15(1H,d,J=0.5

Hz,H-2),7.46(1H,d,J=1.0 Hz,H-4),11.18(1H,s,β-OH),13.13(1H,s,α-OH)。1H-NMR数据与文献一致[7],确定该化合物为大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物Ⅷ:黄色针晶(氯仿-甲醇),mp 208.4~209.3℃。Borntrager′s反应酸水解呈红色,示可能

为羟基蒽醌苷。IRνKBrmax(cm-1):3 383(OH),1 704(未缔合C=O伸缩振动),1 631(缔合C=O伸缩振动),1 600,1 570(芳环)。ESI-MSm/z:271.0(苷元+1),497.1(M++Na,基峰)。1H-NMR(DMSO-d6)δ: 2.02 (1H,s,COCH3), 2.41 (3H, s, CH3),3.23~4.34(6H,m,糖上6个H),5.08,5.12,5.26(1H each,d,糖上C2~4-OH),5.10(1H,d,J=7.6Hz,糖上端基H),6.97(1H,d,J=2.4 Hz,H-7)7.31(1H,d,J=2.4 Hz,H-5),7.16(1H,s,H-2),7.47(1H,d,J=1.2 Hz,H-4),11.16(1H,s,β-OH),13.14(1H,s,α-OH)。1H-NMRδ:170.2,20.6及1H-NMRδ:2.02(3H,s)表明分子中有乙酰基。将1H-NMR数据与化合物Ⅶ比较,苷元一致,糖部分C6′化学位移值向低场移动2.6,C5′化学位移值向高场移动3.3,表明葡萄糖C6′位连有乙酰基。确定该化合物为大黄素-8-O-(6′-O-乙酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物Ⅸ:黄色针晶(氯仿-甲醇),mp 234.4~234.7℃。Borntrager′s反应酸水解呈红色,示可能

为羟基蒽醌苷。IRνKBrmax(cm-1):3 385(OH),1 670(未缔合C=O伸缩振动),1 631(缔合C=O伸缩振动), 1 595, 1 562 (芳环)。ESI-MSm/z: 285.0(M+-glc+1,基峰),469.1(M++Na)。1H-NMR(DMSO-d6)δ:2.42(3H,s,CH3),3.18~3.76(6H,m,糖上6个H),3.97(3H,s,OCH3),4.60(1H,t,J=5.5 Hz,糖上C6-OH),4.99~5.04(3H,m,糖上C2~4-OH),5.16(1H,d,J=7.7 Hz,糖上端基H),7.20(1H,d,J=2.5 Hz,H-7),7.38(1H,d,J=2.5Hz,H-5),7.18(1H,s,H-2),7.50(1H,s,H-4),13.05(1H,s,α-OH)。1H-NMR数据与文献一致[7],确定该化合物为大黄素甲醚-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

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量化鉴别

蒽醌类成分的化学检识

(1) 碱液试验：取上述分离所得游离蒽醌类化合物结晶各 5mg 置于小试管中， 加 95% 乙醇1ml 溶解，再加 10% 氢氧化钠水溶液2~3滴，观察溶液颜色变化。凡具有邻、对位酚羟基的蒽醌类化合物应呈紫-蓝色，其它羟基蒽醌类化合物多为红色。

(2) 醋酸镁试验：取上述分离所得游离蒽醌类化合物结晶各 5mg 置于小试管中，