第六章
纯培养(pure culture)——微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代,称纯培养.
纯培养的方法：见PPT第七章里的第七张 稀释倒平板法
首先将待分离的样品进行连续稀释,目的是得到高度稀释的效果,使一支试管中分配不到一个微生物.如果经过稀释后的大多数试管中没有微生物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是由一个微生物个体繁殖而来的纯培养物. 这种方法适合于细胞较大的微生物. 平板划线分离法
分区划线（适用于浓度较大的样品） 连续划线（适用于浓度较小的样品） 选择培养基分离法 倾注平板法 平板涂布分离法
简单易行，但易造成机械损伤 单细胞（单孢子）分离法 要在显微镜下进行 倾注平板法
比较常用的方法,但对热敏感菌及严格耗氧菌不太适合.
典型的生长曲线：课本153
典型生长曲线粗分为延滞期、指数期、稳定期和衰亡期等 4 个时期
延滞期：延滞期又称停滞期、调整期或适应期。指少量单细胞微生物接种到新鲜培养液中后,在开始培养的一段时间内, 因代谢系统适应新环境的需要, 细胞数目没有增加的一段时期。
该期的特点为:
①生长速率常数为零; ②细胞形态变大或增长, 许多杆菌可长成丝状③细胞内的 RNA 尤其是 rRNA 含量增高, 原生质呈嗜碱性; ④合成代谢十分活跃, 核糖体、酶类和 ATP 的合成加速, 易产生各种诱导酶; ⑤对外界不良条件如 NaCl 溶液浓度、温度和抗生素等理、化因素反应敏感。
影响延滞期长短的因素很多, 除菌种外, 主要有 3 种:
1.接种龄 指接种物或种子的生长年龄, 即它生长到生长曲线上哪一阶段时用来作种子的。这是指某一群体的生理年龄。实验证明, 如果以对数期接种龄的种子接种, 则子代培养物的延滞期就短; 反之, 如以延滞期或衰亡期的种子接种则子代培养物的延滞期就长; 如果以稳定期的种子接种, 则延滞期居中。
2.接种量 接种量的大小明显影响延滞期的长短。一般说来, 接种量大, 则延滞期 短, 反之则长因此, 在发酵工业上, 为缩短延滞期以缩短生产周期, 通常都采 用较大的接种量( 种子∶发酵培养基 = 1∶10 , V/ V ) 。
3.培养基成分 接种到营养丰富的天然培养基中的微生物, 要比接种到营养单调的 组合培养基中的延滞期短。所以, 一般要求发酵培养基的成分与种子培养基的成分尽量 接近, 且应适当丰富些。
出现延滞期的原因, 是由于接种到新鲜培养液的种子细胞中, 一时还缺乏分解或催化有关底物的酶或辅酶, 或是缺乏充足的中间代谢物。为产生诱导酶或合成有关的中间代谢物, 就需要有一段用于适应的时间, 此即延滞期。
指数期：指数期又称对数期( logarithmic phase ) , 指在生长曲线中, 紧接着延滞期的一段细胞数
以几何级数增长的时期。
指数期的特点是: ①生长速率常数R最大, 因而细胞每分裂一次所需的时间--代时，或原生质增加一倍所需的倍增时间最短; ②细胞进行平衡生长, 故菌体各部分的成分十分均匀; ③酶系活跃, 代谢旺盛。
影响指数期微生物代时长短的因素很多, 主要是:
①菌种: 不同 菌种其代时差别极大,
②营养成分: 同一种微生物, 在营养丰富的培养基上生长时, 其代时较短, 反之则长
③营养物浓度: 营养物的浓度既可影响微生物的生长速率, 又可影响它的生长总量，只有在营养物浓度很低( 0.1 ～2.0 mg/ mL) 时, 才会影响微生物的生长速率。随着营养物浓度的逐步
提高( 2.0 ～8.0 mg/ mL ) , 生长速率不受影响, 而仅影响到最终的菌体产量。如进一步提高营养物浓度,则已不再影响生长速率和菌体产量了。凡处于较低浓度范围内可影响生长速率和菌体产量的某营养物,就称 生 长 限 制 因 子
④培养温度: 温度对微生物的生长速率有明显的影响
指数期的微生物因其具有整个群体的生理特性较一致、细胞各成分平衡增长和生长速率恒定等优点, 故是用作代谢、生理等研究的良好材料, 是增殖噬菌体的最适宿主, 也是发酵工业中用作种子的最佳材料 稳定期
稳定期又称恒定期或最高生长期。
其特点是生长速率常数 R 等于零, 即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等, 或正生长与负生长相等的动态平衡之中。这时的菌体产量达到了最高点, 而且菌体产量与营养物质的消耗间呈现出有规律的比例关系,
进入稳定期时, 细胞内开始积聚糖原、异染颗粒和脂肪等内含物; 芽孢杆菌一般在这时开始形成芽孢; 有的微生物在这时开始以初生代谢物作前体, 通过复杂的次生代谢途径合成抗生素等对人类有用的各种次生代谢物。所以, 次生代谢物又称稳定期产物。由此还可对生长期进行另一种分类, 即以指数期为主的菌体生长期和以稳定期为主的代谢产物合成期。
稳定期到来的原因是: ①营养物尤其是生长限制因子的耗尽; ②营养物的比例失调
稳定期的生长规律对生产实践有着重要的指导意义, 例如, 对以生产菌体或与菌体生长相平行的代谢产物(SCP、乳酸等)为目的的某些发酵生产来说, 稳定期是产物的最佳收获期;对维生素、碱基、氨基酸等物质进行生物测定(bioassay) 来说, 稳定期是最佳测定时期; 此外,通过对稳定期到来原因的研究, 还促进了连续培养原理的提出和工艺、技术的创建
衰亡期( decline phase 或 death phase)
在衰亡期中, 微生物的个体死亡速度超过新生速度, 整个群体呈现负生长状态。这时, 细胞形态
发生多形化, 例如会发生膨大或不规则的退化形态; 有的微生物因蛋白水解酶活力的增强而发生自溶( autolysis) ; 有的微生物在这期会进一步合成或释放对人类有益的抗生素等次生代谢物; 而在芽孢杆菌中, 往往在此期释放芽孢; 等等。
产生衰亡期的原因主要是外界环境对继续生长越来越不利, 从而引起细胞内的分解代谢明显超过合成代谢, 继而导致大量菌体死亡。 恒浊与恒化培养的区别
装 置 控制对象 培养基 培养基流速 生长速率 产 物 应用范围 恒浊器 菌体密度 ( 内控制) 培养基流速 ( 外控制) 无限制生 不恒定 长因子 有限制生 恒定 长因子 大量菌体或与菌体相平 最高速率 行的代谢产物 低于最高速 不同生长速率的菌体 率 生产为主 恒化器 实验室为主
厌氧菌因不能合成 SOD, 所以根本无法使 O2· 歧化成 H2 O2 , 因此, 在有氧存在时, 细胞内形成的
O2· 就 使 自 身 受 到 毒 害
PH调节：
过酸时: 加 NaOH、Na2 CO3 等碱液中和
“治标”
过碱时: 加 H2 SO4 、HCl 等酸液中和
过酸时 加适当氮源: 加尿素、NaNO3 、NH4 OH
或蛋白质等
提高通气量
“治本”
过碱时 加适当碳源: 加糖、乳酸、醋酸、柠檬酸或油脂等
降低通气量 灭菌( sterilization)：
采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施, 称为灭菌,
灭菌实质上还可分杀菌( bacteriocidation) 和溶菌( bacteriolysis) 两种, 前者指菌体虽死, 但形体尚存; 后者指菌体被杀死后, 其细胞因发生自溶、裂解等而消失的现象
消毒：是采用较温和的理化因素, 仅杀死物体表面或内部一部分对人体或动、植物有害的病原菌,而对被消毒的对象基本无害的措施 1. 干热灭菌法(dry heat sterilization)
把金属器械或洗净的玻璃器皿放入电热烘箱内, 在 150～170℃下维持 1 ～2 h 后, 可达到彻底灭菌的目的。干热可使细胞膜破坏、蛋白质变性和原生质干燥, 并可使各种细胞成分发生氧化变质。
灼烧是一种最彻底的干热灭菌法, 可是因其破坏力很强, 故应用范围仅限于接种环、接种针的灭菌或带病原菌的材料、动物尸体的烧毁等。 2. 湿热灭菌法(moist heat sterilization)
湿热灭菌法是指用 100℃以上的加压蒸气进行灭菌。在同样温度和相同作用时间下, 湿热灭菌法比干热灭菌法更有效, 原因是湿热蒸气不但透射力强, 而且还能破坏维持蛋白质空间结构和稳定性的氢键, 从而加速这一重要生命大分子物质的变性。
在湿热温度下, 多数细菌和真菌的营养细胞在 60℃左右处理 5 ～10 min 后即被杀死,酵母菌细胞和真菌的孢子稍耐热些, 要在 80℃下才被杀死, 细菌的芽孢最耐热, 一般要在120℃下处理 15 min 才被杀死。
①巴氏消毒法: 因最早由法国微生物学家巴斯德用于果酒消毒, 故名。这是一种专用于牛奶、啤酒、果酒或酱油等不宜进行高温灭菌的液态风味食品或调料的低温消毒方法。此法可杀灭物料中的无芽孢病原菌 , 又不影响其原有风味。巴氏消毒法是一种低温湿热消毒法, 处理温度变化很大, 一般在 60～85℃处理 30 min 至 15 s。具体方法可分两类: 第一类是经典的低温维持法, 例如用于牛奶消毒只要在 63℃下维持 30 min 即可; 第二 类是较现代的高温瞬时法, 用此法作牛奶消毒时只要在 72℃下保持 15 s。
②煮沸消毒法: 采用在 100℃下煮沸数分钟的方法, 一般用于饮用水的消毒。
第六章微生物解析
